急性腦出血患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與腦相關(guān)抗原的特征及其相關(guān)性研究.pdf

1、背景與目的:
　　目前腦卒中的死亡率已經(jīng)位居全球疾病的第二位，我國第一位。腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是卒中的一種重要類型。急性ICH患者病死率和致殘率均較高，且缺乏有效的治療手段。大多數(shù)病例會(huì)遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙，常需要長期的康復(fù)訓(xùn)練及生活護(hù)理，因此給家庭乃至社會(huì)都帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和生活負(fù)擔(dān)。
　　ICH的病理損傷主要包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。大量研究表明免疫反應(yīng)在ICH后腦組

2、織的繼發(fā)性損傷中起重要作用。急性ICH后的系統(tǒng)性免疫反應(yīng)主要包括免疫激活和隨后的免疫抑制。前者主要包括小膠質(zhì)細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥相關(guān)細(xì)胞的腦內(nèi)浸潤，以及促炎癥因子的分泌和釋放。后者主要包括卒中誘導(dǎo)的免疫抑制。急性 ICH之后，腦抗原通過損傷的血腦屏障釋放入血。腦抗原和卒中的嚴(yán)重性及預(yù)后緊密相關(guān)。ICH之后的免疫抑制能夠避免針對腦抗原的過度免疫反應(yīng)，但免疫抑制也可以降低機(jī)體對各種病原體的抵抗力，導(dǎo)致各種感染的

3、發(fā)生。感染是卒中后死亡的重要原因之一。ICH后免疫狀態(tài)的改變和時(shí)間依賴性地招募各種炎癥細(xì)胞，表明大多數(shù)的炎癥細(xì)胞展現(xiàn)有利的和不利的雙重作用。中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特征和作用已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但是特別的淋巴細(xì)胞亞群，尤其是 T淋巴細(xì)胞亞群在ICH之后的適應(yīng)性免疫反應(yīng)過程中的作用尚不清楚。
　　CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）通常被認(rèn)為在維持免疫平衡和抵抗免疫失衡引起的組織損傷過程中起關(guān)鍵作用。最新研

4、究表明，Tregs在調(diào)節(jié)卒中誘導(dǎo)的免疫損傷和隨后的免疫抑制起重要作用，但機(jī)制尚不明確。目前關(guān)于Tregs的進(jìn)展主要集中在缺血性卒中，尚缺乏針對ICH患者的相關(guān)研究。在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)主要研究ICH患者外周血Tregs的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)改變、神經(jīng)功能障礙、腦相關(guān)抗原和肺炎以及它們之間的相關(guān)性，為尋找利用急性ICH患者的Tregs進(jìn)行免疫治療提供理論依據(jù)。
　　材料和方法:
　　1.1 ICH患者及對照組選擇
　　急性IC

5、H患者診斷和治療根據(jù)AHA/ASA的ICH指南進(jìn)行，患者都經(jīng)過頭部CT或MRI明確出血性病灶。納入ICH患者70人，同時(shí)選取60例過去無卒中病史的健康人員作為對照組，兩組的年齡及性別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)神經(jīng)功能缺損程度又區(qū)分為輕中度患者及重度患者。本研究所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。
　　1.2標(biāo)本采集
　　分別于ICH第3天、第7天時(shí)清晨空腹采集患者抗凝血。采用EDTA作為抗

6、凝劑。同時(shí)送檢常規(guī)檢測。
　　1.3 ICH患者卒中后肺炎發(fā)生情況測定
　　于出血后第3天、第7天評定ICH患者卒中后肺炎發(fā)生情況，卒中相關(guān)肺炎的診斷根據(jù)臨床表現(xiàn)和體格檢查（包括肺部的聽診和叩診、膿性呼吸道分泌物、發(fā)熱）、痰培養(yǎng)、胸片或肺部CT的結(jié)果確定。
　　1.4流式細(xì)胞儀單克隆抗體熒光檢測
　　血標(biāo)本采集后立刻處理進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)單克隆熒光抗體表面染色。采用密度梯度離心方法獲得單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)表面染色后，破膜進(jìn)行

7、胞內(nèi)染色。應(yīng)用流式細(xì)胞儀FACScalibur及其分析軟件獲取數(shù)據(jù)。
　　1.5 ELISA方法檢測轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor，TGF-β）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）血漿水平
　　1.6 ELISA方法檢測腦相關(guān)抗原NSE、S100B及MBP血漿濃度
　　結(jié)果:
　　2.1淋巴細(xì)胞亞群
　　ICH患者外周血CD3+細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百

8、分比3天組、7天組為（67.96±7.331，66.19±7.439％），與對照組69.22±7.166%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 ICH患者CD3+CD4+細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比，3天組、7天組為（44.32±8.614，42.24±7.653%），與對照組44.52±7.247%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　ICH患者外周血 CD3+CD69+細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比3天組為、7天組為（4.669±

9、2.842，5.739±2.954%），對照組為2.622±2.159%。ICH3天組與對照組比較，活化的 T細(xì)胞比例明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；ICH7天組與對照組比較，活化的T細(xì)胞比例明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。2.2外周血Tregs
　　ICH患者外周血Tregs占CD4+細(xì)胞百分比（Treg%），3天組、7天組為（5.569±2.597，6.653±2.924%），對照組為4.199±1

10、.869%。ICH3天組與對照組比較，外周血Tregs百分比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ICH7天組與對照組比較，外周血Tregs百分比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；
　　2.3病情輕重及性別對Tregs的影響
　　ICH3天組，外周血Treg%病情重的患者為6.301±2.654%，輕中度的患者為4.793±2.329%，兩者比較重度組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在ICH

11、7天組，外周血Treg%病情重的患者為7.641±2.950%，輕中度的患者為5.634±2.560%，兩者比較重度組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　ICH3天組女性外周血Treg%為5.268±2.648%，與男性結(jié)果5.807±2.566%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；7天組女性外周血Treg%為6.292±2.798%，與男性結(jié)果6.944±3.029%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。<

12、br>　　2.4卒中后肺炎與患者Tregs比例的關(guān)系
　　ICH3天組肺炎患者與無肺炎患者 Treg%分別為6.945±2.553%與5.111±2.468%，肺炎患者明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。ICH7天組肺炎患者與無肺炎患者 Treg%分別為7.823±2.771%與6.205±2.884%，肺炎患者明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.5 Tregs相關(guān)細(xì)胞因子
　　ICH患者

13、外周血TGF-β含量，3天組為22.82±3.11 ng/ml、7天組為26.01±3.05 ng/ml，分別與對照組14.18±2.17 ng/ml比較均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；ICH患者外周血IL-10含量，3天組為21.34±2.98 pg/ml、7天組為22.91±3.48 pg/ml，分別與對照組14.15±2.59 pg/ml比較均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.6腦相關(guān)抗

14、原含量
　　ICH3天組NSE血漿含量（23.57±2.897 ng/mL）較對照組（14.33±2.428 ng/mL）明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；ICH7天組血漿NSE含量（22.49±2.956 ng/mL）與對照組相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　ICH3天組S100B血漿含量（377.6±56.74 pg/mL）較對照組（289.9±45.89 pg/mL）明顯升高，差異具有

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；ICH7天組血漿S100B血漿含量（319.9±58.16 pg/mL）與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　ICH3天組MBP血漿含量（6.713±1.232 ng/mL）較對照組（3.401±0.755 ng/mL）明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；ICH7天組血漿MBP含量（7.828±1.394 ng/mL）與對照組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），

16、
　　2.7腦相關(guān)抗原與Tregs相關(guān)性分析
　　外周血NSE含量與Treg%在ICH3天組、7天組均無相關(guān)性（P>0.05）。
　　外周血S100B含量與Treg%在ICH3天組、7天組均呈顯著正相關(guān)（P<0.01）；
　　外周血 MBP含量與Treg%在ICH3天組、7天組均無相關(guān)性（P>0.05）。
　　2.8病情輕重對ICH患者S100B血漿含量的影響
　　ICH3天組，病情重的患者血漿S10

17、0B含量（398.65±55.26 pg/mL）較輕中度患者（355.21±49.92 pg/mL）明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。ICH7天組，病情重的患者血漿S100B含量（339.424±62.008 pg/mL）較輕中度患者（299.750±46.783 pg/mL）明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.9外周血S100B分別與TGF-β、IL-10的相關(guān)性分析
　　在ICH3天組，外

18、周血S100B與TGF-β含量呈顯著正相關(guān)（P<0.01）；在ICH7天組，外周血S100B與外周血TGF-β含量呈顯著正相關(guān)（P<0.01）。
　　外周血S100B與IL-10血漿水平在ICH3天組、7天組均無相關(guān)性（P>0.05）
　　結(jié)論:
　　3.1 ICH患者急性出血之后促發(fā)系統(tǒng)和外周免疫反應(yīng)，導(dǎo)致激活的外周T細(xì)胞增多。
　　3.2 ICH患者外周血Tregs比例明顯增多，以及相應(yīng)的細(xì)胞因子TGF-β和

19、IL-10含量增高，提示Tregs參與調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)。
　　3.3嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙的ICH患者外周血Tregs比例較輕中度患者增高更為顯著，提示病情嚴(yán)重程度影響外周血Tregs水平。
　　3.4發(fā)生肺炎的ICH患者外周血Tregs比例較未發(fā)生肺炎的患者增高更為顯著，提示感染影響外周血Tregs水平。
　　3.5 ICH患者腦抗原NSE、S100B和MBP釋放增多，提示腦抗原可能促發(fā)自身免疫反應(yīng)。此外，S100B蛋白在