補(bǔ)腎活血化痰法對秀麗線蟲抗氧化及Aβ蛋白毒性作用研究.pdf

1、目的：
　　本論文從補(bǔ)腎活血化痰法的文獻(xiàn)探討出發(fā)，梳理其基本概念和理論淵源，從而分析補(bǔ)腎活血化痰法對衰老及老年性癡呆的影響，同時整理并歸納分析了有關(guān)阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease,簡稱AD，老年癡呆癥的主要類型）病理過程中Aβ（amyloid-β peptide）蛋白聚積毒性與氧化損傷之間關(guān)系的相關(guān)文獻(xiàn)。在此基礎(chǔ)上，從導(dǎo)師科研團(tuán)隊(duì)前期研究基礎(chǔ)出發(fā)，以衰老和老年性癡呆為切入點(diǎn)，選用補(bǔ)腎名方六味地黃丸作為補(bǔ)腎法代

2、表方，通過與化痰法代表方二陳湯、活血法代表藥三七配伍進(jìn)行研究，分為六味地黃丸加三七（簡稱補(bǔ)腎活血組）、六味地黃丸加二陳湯（簡稱補(bǔ)腎化痰組）、六味地黃丸加二陳湯和三七（簡稱補(bǔ)腎活血化痰組）等處理組，以秀麗線蟲（Caenorhabditiselegans）野生型（N2）和轉(zhuǎn)基因AD模型（CL4176）為研究對象，通過氧化水平調(diào)節(jié)、Aβ蛋白毒性緩解、衰老相關(guān)基因調(diào)控等方面的分析，闡釋補(bǔ)腎活血化痰法對防治癡呆和延緩衰老的作用機(jī)制，同時為抗AD藥

3、物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.理論探討：整理補(bǔ)腎活血化痰治法對衰老和癡呆作用的文獻(xiàn)，并探討現(xiàn)代研究補(bǔ)腎活血化痰藥的抗氧化作用與緩解 Aβ蛋白毒性作用之間的關(guān)系，從而評價補(bǔ)腎活血化痰法對AD和衰老的作用，并初步判斷其作用機(jī)制。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究：分別選用N2（野生型）和CL4176（轉(zhuǎn)基因AD模型）秀麗線蟲為動物模型進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。其中，CL4176秀麗線蟲因其肌肉細(xì)胞中 Aβ的表達(dá)在表型上出現(xiàn)抽搐癥狀，同時

4、具有 AD相關(guān)癥狀和病理變化。本論文首先進(jìn)行了癱瘓緩解實(shí)驗(yàn)，以此篩選具有緩解Aβ毒性作用的活性藥物組及藥物有效濃度。同時，通過百草枯氧化脅迫實(shí)驗(yàn)，篩選出具有抗氧化作用的藥物組及有效濃度。然后通過比較分析藥物抗氧化作用與緩解Aβ毒性之間的關(guān)系，確定具有抗氧化且能緩解Aβ毒性的活性藥物組及其有效濃度。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展了以下系列實(shí)驗(yàn)：壽命、熱應(yīng)激、繁殖能力、運(yùn)動能力等衰老相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以分析活性藥物對衰老的影響；活性氧（ROS）水平、SOD和

5、CAT等抗氧化酶活性以及丙二醛（MDA）含量測定，以探討活性藥物對氧化應(yīng)激的影響；通過熒光定量PCR對氧化應(yīng)激相關(guān)基因skn-1/Nrf2以及熱休克蛋白家族基因hsp16.2和hsp60等進(jìn)行分析，以探討藥物防治AD及延緩衰老的作用機(jī)制；采用硫磺素T（ThT)染色法進(jìn)行Aβ蛋白體外聚集實(shí)驗(yàn)，以檢測藥物對Aβ蛋白聚集的作用。通過以上實(shí)驗(yàn)，探討補(bǔ)腎活血化痰法對于AD作用機(jī)制及其與壽命影響之間的可能關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.對秀

6、麗線蟲體內(nèi)Aβ毒性作用的影響：藥物對秀麗線蟲癱瘓緩解程度可以反映藥物對秀麗線蟲Aβ毒性的作用。通過誘導(dǎo)癱瘓后對秀麗線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎活血組、補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎活血化痰組均具有緩解Aβ蛋白毒性的作用，其中補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎活血組和補(bǔ)腎化痰組有效作用的最佳濃度均為50 mg/ml，補(bǔ)腎活血化痰組有效作用的最佳濃度為100 mg/ml。通過進(jìn)一步對四種治法緩解Aβ毒性的效果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血組緩解效果最明顯，其余依次為補(bǔ)腎活

7、血化痰組、補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎組。因本實(shí)驗(yàn)在固體培養(yǎng)基上開展，因此所獲得的最佳藥物濃度為后續(xù)固體培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)濃度。
　　2.對秀麗線蟲抗氧化能力的影響：抗氧化相關(guān)實(shí)驗(yàn)包括百草枯氧化脅迫實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)ROS水平、SOD和CAT活性以及MDA含量等的檢測。通過百草枯氧化脅迫造模，觀察抗氧化損傷后秀麗線蟲存活時間來反映藥物的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，藥物組均能明顯提高秀麗線蟲在百草枯脅迫下的存活能力，補(bǔ)腎組最佳有效濃度為40mg/

8、ml，補(bǔ)腎活血組為60mg/ml，補(bǔ)腎化痰組為0-100h內(nèi)最佳濃度為40mg/ml，100h以后為60mg/ml，補(bǔ)腎活血化痰組為60mg/ml,將篩選濃度后的各組方最佳濃度再次進(jìn)行氧化脅迫實(shí)驗(yàn)，得到結(jié)果顯示，在0-120h內(nèi)，以補(bǔ)腎活血化痰組效果最佳，120h以后補(bǔ)腎活血組效果最佳，其次為補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎組，此實(shí)驗(yàn)以液體培養(yǎng)進(jìn)行，因此所確定的有效濃度為液體培養(yǎng)法濃度。通過ROS水平檢測，發(fā)現(xiàn)各組藥物均可顯著降低秀麗線蟲體內(nèi)的ROS水

9、平，其中補(bǔ)腎活血組ROS水平最低，其次為補(bǔ)腎活血化痰組、補(bǔ)腎化痰組，補(bǔ)腎組效果較其他藥物組ROS水平低，因此，藥物抗氧化作用效果由大到小依次為補(bǔ)腎活血組、補(bǔ)腎活血化痰組、補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎組；相比于空白對照組，補(bǔ)腎組及其他藥物組均能顯著增強(qiáng)氧化脅迫造模后秀麗線蟲體內(nèi)SOD活力，其中以補(bǔ)腎活血組SOD活力最為明顯(p<0.01)，其次為補(bǔ)腎活血化痰組（p<0.05）、補(bǔ)腎化痰組（p<0.05）、補(bǔ)腎組（p<0.05）。CAT活力最強(qiáng)為補(bǔ)腎活

10、血化痰組（p<0.05），其次為補(bǔ)腎活血組（p<0.05）、補(bǔ)腎化痰組（p<0.05）、補(bǔ)腎組（p<0.05）。對比空白組，補(bǔ)腎活血化痰組能顯著降低氧化脅迫下秀麗線蟲體內(nèi)的MDA含量(p<0.01)，其次為補(bǔ)腎化痰組（p<0.05）、補(bǔ)腎活血組（p<0.05）。補(bǔ)腎組結(jié)果顯示MDA含量無明顯降低。補(bǔ)腎活血化痰法可通過抗氧化損傷，緩解Aβ毒性，保護(hù)神經(jīng)元，體現(xiàn)了補(bǔ)腎活血化痰法在對抗秀麗線蟲Aβ毒性作用過程中發(fā)揮了主要作用。
　　3.

11、對秀麗線蟲壽命的影響：壽命相關(guān)實(shí)驗(yàn)包括固體壽命實(shí)驗(yàn)、熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)、繁殖力實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動能力實(shí)驗(yàn)等。壽命實(shí)驗(yàn)中藥物為癱瘓緩解實(shí)驗(yàn)所篩選出的最佳濃度，補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎活血組濃度取50mg/ml，補(bǔ)腎活血化痰組濃度取100mg/ml，壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與空白組壽命周期比較，各藥物組均能顯著延長秀麗線蟲的平均壽命，其空白組平均壽命為18.975±0.175天，補(bǔ)腎組平均壽命為21.842±0.190天（p<0.05),補(bǔ)腎活血組平均壽命為22.9

12、43±0.194天(p<0.05),補(bǔ)腎活血化痰組平均壽命為25.651±0.106天（p<0.001)，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四種治法延緩衰老的效果進(jìn)行綜合比較，補(bǔ)腎活血化痰組抗衰效果最佳，其次為補(bǔ)腎活血組，其次補(bǔ)腎化痰組，最后為補(bǔ)腎組；熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與空白組比較，各藥物組均可延長秀麗線蟲熱應(yīng)激時平均存活時間，其中補(bǔ)腎化痰組抗熱應(yīng)激效果最佳，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),熱應(yīng)激效果其他藥物組依次為補(bǔ)腎活血組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎化痰組

13、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；繁殖力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，生殖高峰期子代數(shù)目，空白組為168.7±25.2條，補(bǔ)腎組(50mg/ml)為244.7±22.8條（p<0.001),補(bǔ)腎活血組為280.6±20.7條（p<0.001)，補(bǔ)腎化痰組235.7±19.1條（p<0.001)，補(bǔ)腎活血化痰組為274.7±20.5條（p<0.001)，對比于空白組，各藥物組均明顯提高秀麗線蟲生殖能力（P<0.01）,其中補(bǔ)腎活血組作用更為顯著，其他藥物效

14、果依次為補(bǔ)腎活血化痰組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎化痰組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；運(yùn)動能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，身體彎曲次數(shù)最多為補(bǔ)腎活血組，表明補(bǔ)腎活血法對運(yùn)動能力的影響明顯優(yōu)于其他組，其次為補(bǔ)腎活血化痰組、補(bǔ)腎組，和補(bǔ)腎化痰組。
　　4.補(bǔ)腎活血化痰法對抗氧化基因、主要熱休克蛋白家族基因的影響以Real-Time PCR的2-△△CT值表示相關(guān)基因在秀麗線蟲體內(nèi)的m RNA的相對表達(dá)水平。各藥物組結(jié)果，與 act-1 m RNA相比，skn-1 mRNA

15、水平明顯上調(diào)，表明補(bǔ)腎活血化痰法緩解秀麗線蟲Aβ毒性作用機(jī)制可能與skn-1/Nrf2抗氧化作用途徑有關(guān)。使用RT-PCR的方法進(jìn)一步探究了藥物對于主要熱休克蛋白家族基因表達(dá)情況的影響，主要研究了熱休克蛋白家族代表如hsp-16.2、hsp-60基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示AD模型線蟲體內(nèi)，補(bǔ)腎活血化痰法對熱休克蛋白基因hsp-16.2 m RNA、hsp-60 m RNA表達(dá)未見明顯上調(diào)或下調(diào)。
　　5.補(bǔ)腎活血化痰法對Aβ蛋白體外

16、聚集的影響
　　結(jié)果顯示，藥物與Aβ一起孵育，但并不影響Aβ蛋白體外聚集過程，因此結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血化痰法對線蟲體內(nèi)Aβ的清除作用不是通過直接競爭性結(jié)合Aβ蛋白單體實(shí)現(xiàn)的，而很可能是通過與體內(nèi)某些應(yīng)激壓力作用有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.補(bǔ)腎活血化痰法對于延緩Aβ毒性及延緩壽命均具有顯著作用，其治療作用明顯優(yōu)于補(bǔ)腎法、補(bǔ)腎活血及補(bǔ)腎化痰法，抗氧化作用則以補(bǔ)腎活血法最為顯著。
　　2.對緩解Aβ毒性作用有效的藥物多具