補腎活血化痰法對秀麗線蟲抗氧化及Aβ蛋白毒性作用研究.pdf

1、目的：
　　本論文從補腎活血化痰法的文獻探討出發(fā)，梳理其基本概念和理論淵源，從而分析補腎活血化痰法對衰老及老年性癡呆的影響，同時整理并歸納分析了有關阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease,簡稱AD，老年癡呆癥的主要類型）病理過程中Aβ（amyloid-β peptide）蛋白聚積毒性與氧化損傷之間關系的相關文獻。在此基礎上，從導師科研團隊前期研究基礎出發(fā)，以衰老和老年性癡呆為切入點，選用補腎名方六味地黃丸作為補腎法代

2、表方，通過與化痰法代表方二陳湯、活血法代表藥三七配伍進行研究，分為六味地黃丸加三七（簡稱補腎活血組）、六味地黃丸加二陳湯（簡稱補腎化痰組）、六味地黃丸加二陳湯和三七（簡稱補腎活血化痰組）等處理組，以秀麗線蟲（Caenorhabditiselegans）野生型（N2）和轉基因AD模型（CL4176）為研究對象，通過氧化水平調節(jié)、Aβ蛋白毒性緩解、衰老相關基因調控等方面的分析，闡釋補腎活血化痰法對防治癡呆和延緩衰老的作用機制，同時為抗AD藥

3、物的研發(fā)奠定基礎。
　　方法：
　　1.理論探討：整理補腎活血化痰治法對衰老和癡呆作用的文獻，并探討現(xiàn)代研究補腎活血化痰藥的抗氧化作用與緩解 Aβ蛋白毒性作用之間的關系，從而評價補腎活血化痰法對AD和衰老的作用，并初步判斷其作用機制。
　　2.實驗研究：分別選用N2（野生型）和CL4176（轉基因AD模型）秀麗線蟲為動物模型進行相關實驗研究。其中，CL4176秀麗線蟲因其肌肉細胞中 Aβ的表達在表型上出現(xiàn)抽搐癥狀，同時

4、具有 AD相關癥狀和病理變化。本論文首先進行了癱瘓緩解實驗，以此篩選具有緩解Aβ毒性作用的活性藥物組及藥物有效濃度。同時，通過百草枯氧化脅迫實驗，篩選出具有抗氧化作用的藥物組及有效濃度。然后通過比較分析藥物抗氧化作用與緩解Aβ毒性之間的關系，確定具有抗氧化且能緩解Aβ毒性的活性藥物組及其有效濃度。在此基礎上進一步開展了以下系列實驗：壽命、熱應激、繁殖能力、運動能力等衰老相關實驗，以分析活性藥物對衰老的影響；活性氧（ROS）水平、SOD和

5、CAT等抗氧化酶活性以及丙二醛（MDA）含量測定，以探討活性藥物對氧化應激的影響；通過熒光定量PCR對氧化應激相關基因skn-1/Nrf2以及熱休克蛋白家族基因hsp16.2和hsp60等進行分析，以探討藥物防治AD及延緩衰老的作用機制；采用硫磺素T（ThT)染色法進行Aβ蛋白體外聚集實驗，以檢測藥物對Aβ蛋白聚集的作用。通過以上實驗，探討補腎活血化痰法對于AD作用機制及其與壽命影響之間的可能關系。
　　結果：
　　1.對秀

6、麗線蟲體內Aβ毒性作用的影響：藥物對秀麗線蟲癱瘓緩解程度可以反映藥物對秀麗線蟲Aβ毒性的作用。通過誘導癱瘓后對秀麗線蟲進行計數和分析，發(fā)現(xiàn)補腎組、補腎活血組、補腎化痰組和補腎活血化痰組均具有緩解Aβ蛋白毒性的作用，其中補腎組、補腎活血組和補腎化痰組有效作用的最佳濃度均為50 mg/ml，補腎活血化痰組有效作用的最佳濃度為100 mg/ml。通過進一步對四種治法緩解Aβ毒性的效果進行比較分析，發(fā)現(xiàn)補腎活血組緩解效果最明顯，其余依次為補腎活

7、血化痰組、補腎化痰組和補腎組。因本實驗在固體培養(yǎng)基上開展，因此所獲得的最佳藥物濃度為后續(xù)固體培養(yǎng)法的實驗濃度。
　　2.對秀麗線蟲抗氧化能力的影響：抗氧化相關實驗包括百草枯氧化脅迫實驗、體內ROS水平、SOD和CAT活性以及MDA含量等的檢測。通過百草枯氧化脅迫造模，觀察抗氧化損傷后秀麗線蟲存活時間來反映藥物的抗氧化能力。實驗結果顯示，與空白組比較，藥物組均能明顯提高秀麗線蟲在百草枯脅迫下的存活能力，補腎組最佳有效濃度為40mg/

8、ml，補腎活血組為60mg/ml，補腎化痰組為0-100h內最佳濃度為40mg/ml，100h以后為60mg/ml，補腎活血化痰組為60mg/ml,將篩選濃度后的各組方最佳濃度再次進行氧化脅迫實驗，得到結果顯示，在0-120h內，以補腎活血化痰組效果最佳，120h以后補腎活血組效果最佳，其次為補腎化痰組和補腎組，此實驗以液體培養(yǎng)進行，因此所確定的有效濃度為液體培養(yǎng)法濃度。通過ROS水平檢測，發(fā)現(xiàn)各組藥物均可顯著降低秀麗線蟲體內的ROS水

9、平，其中補腎活血組ROS水平最低，其次為補腎活血化痰組、補腎化痰組，補腎組效果較其他藥物組ROS水平低，因此，藥物抗氧化作用效果由大到小依次為補腎活血組、補腎活血化痰組、補腎化痰組和補腎組；相比于空白對照組，補腎組及其他藥物組均能顯著增強氧化脅迫造模后秀麗線蟲體內SOD活力，其中以補腎活血組SOD活力最為明顯(p<0.01)，其次為補腎活血化痰組（p<0.05）、補腎化痰組（p<0.05）、補腎組（p<0.05）。CAT活力最強為補腎活

10、血化痰組（p<0.05），其次為補腎活血組（p<0.05）、補腎化痰組（p<0.05）、補腎組（p<0.05）。對比空白組，補腎活血化痰組能顯著降低氧化脅迫下秀麗線蟲體內的MDA含量(p<0.01)，其次為補腎化痰組（p<0.05）、補腎活血組（p<0.05）。補腎組結果顯示MDA含量無明顯降低。補腎活血化痰法可通過抗氧化損傷，緩解Aβ毒性，保護神經元，體現(xiàn)了補腎活血化痰法在對抗秀麗線蟲Aβ毒性作用過程中發(fā)揮了主要作用。
　　3.

11、對秀麗線蟲壽命的影響：壽命相關實驗包括固體壽命實驗、熱應激實驗、繁殖力實驗、運動能力實驗等。壽命實驗中藥物為癱瘓緩解實驗所篩選出的最佳濃度，補腎組、補腎化痰組和補腎活血組濃度取50mg/ml，補腎活血化痰組濃度取100mg/ml，壽命實驗結果，與空白組壽命周期比較，各藥物組均能顯著延長秀麗線蟲的平均壽命，其空白組平均壽命為18.975±0.175天，補腎組平均壽命為21.842±0.190天（p<0.05),補腎活血組平均壽命為22.9

12、43±0.194天(p<0.05),補腎活血化痰組平均壽命為25.651±0.106天（p<0.001)，結果均具有統(tǒng)計學意義。四種治法延緩衰老的效果進行綜合比較，補腎活血化痰組抗衰效果最佳，其次為補腎活血組，其次補腎化痰組，最后為補腎組；熱應激實驗結果，與空白組比較，各藥物組均可延長秀麗線蟲熱應激時平均存活時間，其中補腎化痰組抗熱應激效果最佳，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),熱應激效果其他藥物組依次為補腎活血組、補腎組、補腎化痰組

13、，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；繁殖力實驗結果，生殖高峰期子代數目，空白組為168.7±25.2條，補腎組(50mg/ml)為244.7±22.8條（p<0.001),補腎活血組為280.6±20.7條（p<0.001)，補腎化痰組235.7±19.1條（p<0.001)，補腎活血化痰組為274.7±20.5條（p<0.001)，對比于空白組，各藥物組均明顯提高秀麗線蟲生殖能力（P<0.01）,其中補腎活血組作用更為顯著，其他藥物效

14、果依次為補腎活血化痰組、補腎組、補腎化痰組，差異有顯著統(tǒng)計學意義；運動能力實驗結果，身體彎曲次數最多為補腎活血組，表明補腎活血法對運動能力的影響明顯優(yōu)于其他組，其次為補腎活血化痰組、補腎組，和補腎化痰組。
　　4.補腎活血化痰法對抗氧化基因、主要熱休克蛋白家族基因的影響以Real-Time PCR的2-△△CT值表示相關基因在秀麗線蟲體內的m RNA的相對表達水平。各藥物組結果，與 act-1 m RNA相比，skn-1 mRNA

15、水平明顯上調，表明補腎活血化痰法緩解秀麗線蟲Aβ毒性作用機制可能與skn-1/Nrf2抗氧化作用途徑有關。使用RT-PCR的方法進一步探究了藥物對于主要熱休克蛋白家族基因表達情況的影響，主要研究了熱休克蛋白家族代表如hsp-16.2、hsp-60基因的表達情況，結果顯示AD模型線蟲體內，補腎活血化痰法對熱休克蛋白基因hsp-16.2 m RNA、hsp-60 m RNA表達未見明顯上調或下調。
　　5.補腎活血化痰法對Aβ蛋白體外

16、聚集的影響
　　結果顯示，藥物與Aβ一起孵育，但并不影響Aβ蛋白體外聚集過程，因此結果表明，補腎活血化痰法對線蟲體內Aβ的清除作用不是通過直接競爭性結合Aβ蛋白單體實現(xiàn)的，而很可能是通過與體內某些應激壓力作用有關。
　　結論：
　　1.補腎活血化痰法對于延緩Aβ毒性及延緩壽命均具有顯著作用，其治療作用明顯優(yōu)于補腎法、補腎活血及補腎化痰法，抗氧化作用則以補腎活血法最為顯著。
　　2.對緩解Aβ毒性作用有效的藥物多具