補(bǔ)腎活血方藥及補(bǔ)腎方藥對大鼠成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究.pdf

1、[目的]
　　1.研究空白血清不同濃度及補(bǔ)腎活血方藥黃芪三仙湯，補(bǔ)腎方藥金匱腎氣丸各劑量含藥血清對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響，確定培養(yǎng)成骨細(xì)胞的最佳劑量含藥血清濃度。
　　2.研究補(bǔ)腎活血方藥黃芪三仙湯含藥血清、補(bǔ)腎方藥金匱腎氣丸含藥血清及空白血清對成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)差異的影響。
　　3.通過差異蛋白點的質(zhì)譜鑒定，初步了解他們的性質(zhì)、功能。
　　[方法]
　　1.采用混合酶消化法體外分離細(xì)胞，通過形態(tài)

2、學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和細(xì)胞堿性磷酸酶染色鑒定細(xì)胞;制備實驗組補(bǔ)腎活血方藥黃芪三仙湯不同劑量的含藥血清，補(bǔ)腎方藥金匱腎氣丸不同劑量的含藥血清及空白組血清，并用各組血清對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)實驗，采用MTT法觀察各空白血清濃度及各劑量含藥血清濃度對成骨細(xì)胞增殖的影響。
　　2.應(yīng)用雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis簡稱2-DE）方法，研究黃芪三仙湯含藥血清，金匱腎氣丸含藥血清及空白血清對成骨細(xì)胞

3、蛋白質(zhì)組的影響，并在重復(fù)實驗中進(jìn)行實驗條件的優(yōu)化與改良;得到的2-DE圖像用Image-Master2D Platinum軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，選取Overlap Ratio絕對值≥2點為差異蛋白點。
　　3.選取10個有明顯表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點進(jìn)行膠內(nèi)胰蛋白酶解，再使用MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜儀一一分析，將質(zhì)譜分析得出的指紋圖譜經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索分析后，識別鑒定各個蛋白質(zhì)。
　　[結(jié)果]
　　1.采用混合酶消化法

4、分離培養(yǎng)出的細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和細(xì)胞堿性磷酸酶呈陽性染色確定培養(yǎng)的細(xì)胞為成骨細(xì)胞。血清干預(yù)實驗中，10％、15％、20％空白血清組與5％空白血清組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而15％、20％空白血清組與10％空白血清組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。黃芪三仙湯等效劑量血清組及2倍等效劑量血清組與0.5倍等效劑量血清組和空白血清組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，2倍等效劑量血清組與等效劑量血清組亦比較差異有統(tǒng)計

5、學(xué)意義(P＜0.05)。金匱腎氣丸等效劑量血清組及2倍等效劑量血清組與0.5倍等效劑量血清組和空白血清組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，2倍等效劑量血清組與等效劑量血清組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而黃芪三仙湯與金匱腎氣丸各等劑量間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.采用優(yōu)化后的雙向凝膠電泳條件取得了重復(fù)性較好的2-DE圖譜;通過Image-Master2D Platinum圖像分析軟件對每組三塊膠圖譜分析后顯示:空

6、白對照組、黃芪三仙湯組、金匱腎氣丸組分別檢測到平均蛋白點數(shù)為(938±26)、(875±34)和(904±22)。經(jīng)分析空白對照組、黃芪三仙湯組、金匱腎氣丸組共有38個蛋白質(zhì)點具有明顯差異。其中與空白組比較，兩加藥組表達(dá)均上調(diào)的蛋白點有5個，表達(dá)均下調(diào)的蛋白點有2個;與空白組比較，金匱腎氣丸組表達(dá)沒有差異，而黃芪三仙湯組表達(dá)上調(diào)的蛋白點有2個，表達(dá)下調(diào)蛋白點有6個;與空白組比較，黃芪三仙湯組表達(dá)沒有差異，而金匱腎氣丸組表達(dá)上調(diào)的蛋白點有

7、16個，下調(diào)的蛋白點有7個。
　　3.送檢的10個差異蛋白點經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS分析獲得了10張肽質(zhì)量指紋圖譜和50張肽片段指紋圖譜，通過蛋白數(shù)據(jù)庫搜索匹配得分大于64分的有8個蛋白點，其中有4個蛋白點鑒定結(jié)果的等電點和分子量都與雙向電泳圖譜中的蛋白點位置比較一致，且匹配的物種也與實驗所用一致，是比較可信的鑒定結(jié)果。
　　[結(jié)論]
　　1.采用混合酶多次消化法可以獲得足夠數(shù)量和純度的成骨細(xì)胞，并且符合成骨

8、細(xì)胞形態(tài)及功能特點，而且此法簡單、實用，適于做體外實驗研究模型。黃芪三仙湯、金匱腎氣丸等效劑量和2倍等效劑量的10％含藥血清濃度對成骨細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用。
　　2.通過蛋白質(zhì)雙向凝膠技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜兼容的硝酸銀染色可以得到分辨率較高，重復(fù)性較好的各實驗組成骨細(xì)胞的蛋白質(zhì)組圖譜，為進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)譜鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　3.10個差異蛋白點質(zhì)譜鑒定出了4個比較可信的蛋白，分別是:抑制素(prohibitin)、轉(zhuǎn)錄延伸因子B