補(bǔ)腎滋陰方藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠治療作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病是糖尿病常見(jiàn)而難治的微血管并發(fā)癥，已成為糖尿病患者的主要死因之一。其發(fā)病機(jī)制主要與高血糖、腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常、家族遺傳性等有關(guān)。 腎素-血管緊張素系統(tǒng)在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，血管緊張素Ⅱ不僅是一種血管活性因子，影響腎臟血流動(dòng)力學(xué)，還是一種生長(zhǎng)因子及促纖維化因子，影響腎臟固有細(xì)胞的生物學(xué)功能。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1。在糖尿病腎病相關(guān)的生長(zhǎng)因子網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位，可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腎小球肥大、刺激細(xì)胞外基質(zhì)合

2、，參與腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生。 糖尿病腎病與中醫(yī)“消渴”之“下消”關(guān)系密切，“腎陰虧虛”在其發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中具有重要作用，也是早期糖尿病腎病(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)的基本病機(jī)之一，補(bǔ)腎滋陰方藥常用于早期糖尿病腎病治療。六味地黃丸是補(bǔ)腎滋陰的經(jīng)典方劑，很多臨床研究均證實(shí)其對(duì)糖尿病腎病具有良好的治療作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射鏈尿佐菌素的方法先復(fù)制大鼠糖尿病模型，進(jìn)而發(fā)展為糖尿病腎病，觀(guān)察六味地黃湯對(duì)其血糖、腎

3、功能、24小時(shí)尿蛋白定量、腎組織病理形態(tài)學(xué)及腎組織腎素活性、血管緊張素Ⅱ和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)的影響，初步探討本方的作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用補(bǔ)腎滋陰方藥治療早期糖尿病腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分六味地黃湯對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能及腎組織病理形態(tài)學(xué)的影響方法：選用清潔級(jí)雄性健康SD大鼠30只體重200±10g，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨機(jī)抽6只為正常組(NC)，其余大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/kg，正常組注射相應(yīng)量生理鹽水

4、，72小時(shí)后，測(cè)血糖以≥16.65mmol/L，尿糖陽(yáng)性為DM模型成模標(biāo)準(zhǔn)。成模大鼠被隨機(jī)分為：模型組(DM)、苯那普利組(BN)、六味地黃湯(LD)組，成模后一周按成人劑量的20倍給藥，每日一次。六味地黃湯組按25g/kg予六味地黃湯，苯那普利組按6.67mg/kg灌胃，各組共給藥8周；正常組和模型組均灌服相應(yīng)量的生理鹽水。于DM成模后第9周末禁食不禁水留取各組大鼠24小時(shí)尿液檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白定量、尿肌酐(Ucr)；各組大鼠禁食8小

5、時(shí)，稱(chēng)重，麻醉動(dòng)物，股動(dòng)脈取血，分離血清，檢測(cè)空腹血糖(FPG)，血尿素氮(BUN)，血肌酐(Scr)，計(jì)算肌酐清除率(Ccr)。無(wú)菌操作取雙腎，剝離被膜稱(chēng)重，計(jì)算腎重/體重指數(shù)(KW/BW)；取右腎組織4％多聚甲醛初步固定，用于觀(guān)察腎臟病理形態(tài)學(xué)變化；血、尿生化指標(biāo)均用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。 結(jié)果：1 一般情況及空腹血糖、腎重/體重指數(shù)、24h尿蛋白定量：大鼠注射STZ后體重增長(zhǎng)緩慢，毛色差，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，出現(xiàn)腎臟體積增大，尿蛋

6、白增多；空腹血糖模型組與正常組比較明顯增高(P<0.01)，苯那普利組空腹血糖與模型組比較無(wú)明顯變化；六味地黃湯組與模型組比較明顯降低(P<0.05)；24h尿蛋白定量模型組與正常組比較明顯升高(P<0.01)，苯那普利組、六味地黃湯組與模型組比較明顯降低(P<0.05)，六味地黃湯組與苯那普利組比較明顯降低(P<0.05)；腎重/體重指數(shù)模型組與正常組比較明顯增高(P<0.01)，六味地黃湯組、苯那普利組與模型組比較均有顯著降低(P<

7、0.05)，其中六味地黃湯組優(yōu)于苯那普利組但無(wú)顯著性差異。 2 血尿素氮、肌酐清除率的測(cè)定結(jié)果：血尿素氮模型組與正常組比較明顯增高(P<0.01)，苯那普利組與模型組比較均有明顯降低(P<0.05)，六味地黃湯組與苯那普利組比較明顯降低(P<0.01)，仍高于正常組但無(wú)顯著差異；肌酐清除率模型組與正常組比較有顯著性增高(P<0.01)，苯那普利組、六味地黃湯組與模型組比較均有顯著性降低(P<0.05)，六味地黃湯組優(yōu)于苯那普利組但無(wú)顯著

8、性差異。 3.腎組織病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察：HE、PAS染色光鏡下可見(jiàn)正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)腎小球肥大，腎小球毛細(xì)血管基底膜、系膜、基質(zhì)未見(jiàn)明顯異常改變；模型組腎小球系膜區(qū)彌漫性增寬，系膜細(xì)胞輕、中度增生，腎小球基底膜增厚，PAS染色物質(zhì)明顯增多，部分毛細(xì)血管受壓塌陷等表現(xiàn)。苯那普利組、六味地黃湯組的腎小球結(jié)構(gòu)也有類(lèi)似的病理改變，但明顯較模型組減輕(P<0.05)。 第二部分六味地黃湯對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織腎素-血管緊張素系

9、統(tǒng)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的影響方法：動(dòng)物分組、造模方法和給藥方法同第一部分，用放射免疫法測(cè)定腎組織勻漿腎素活性和血管緊張素II水平，結(jié)果用腎組織總蛋白校正，計(jì)算出腎組織每克蛋白中的腎素活性和血管緊張素Ⅱ含量。TGF-β1蛋白表達(dá)采用免疫組織化學(xué)PV法檢測(cè)，病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)積分光密度和相對(duì)陽(yáng)性面積。結(jié)果：1 腎組織腎素活性和血管緊張素Ⅱ含量：腎素活性模型組顯著高于正常組(P<0.05)，苯那普利組比模型組顯著增高(P<0.05)，六味地黃

10、湯組顯著低于苯那普利組(P<0.05)，六味地黃湯組略低于模型組但無(wú)明顯差異。血管緊張素Ⅱ含量，模型組與正常組比較有顯著增加(P<0.01)；苯那普利組與模型組比較顯著降低(P<0.05)，六味地黃湯組低于苯那普利組但無(wú)顯著性差異。2腎組織TGF-β1的表達(dá)：光鏡下觀(guān)察，模型組TGF-β1表達(dá)主要表達(dá)于腎小球系膜區(qū)，腎小管上皮細(xì)胞也有不同程度表達(dá)，陽(yáng)性顆粒主要位于胞漿中。病理圖象半定量分析：模型組腎小球TGF-β1表達(dá)的相對(duì)面積及積分光

11、密度均明顯高于正常組(P<0.01)；苯那普利組、六味地黃湯組均明顯低于模型組(P<0.05)；六味地黃湯組低于苯那普利組但無(wú)顯著性差異。 結(jié)論： 1.補(bǔ)腎滋陰之六味地黃湯具有改善DN大鼠一般狀態(tài)，降低血糖、BUN和Ccr，改善腎功能，對(duì)早期DN有確切的療效。 2.補(bǔ)腎滋陰之六味地黃湯具有減少DN大鼠尿蛋白的排出，抑制早期腎臟肥大，減輕腎臟病理?yè)p害和延緩腎臟病理進(jìn)展的作用。 3.補(bǔ)腎滋陰之六味地黃湯對(duì)DN