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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是一種高死亡率、高致殘率的神經(jīng)外科急癥。動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血是SAH最常見(jiàn)的類型,約占全部病例的85%。在過(guò)去很長(zhǎng)的一段時(shí)間里,遲發(fā)性腦血管痙攣一直被認(rèn)為是引起SAH患者預(yù)后不良的主要原因,然而在近20年的研究中,該研究方向并沒(méi)有取得突破性進(jìn)展,越來(lái)越多的證據(jù)表明SAH后除遲發(fā)性腦血管痙攣外,還存在其他重要的機(jī)制造成SAH患者預(yù)后不良。近年來(lái),領(lǐng)
2、域內(nèi)的權(quán)威專家提出了早期腦損傷(EarlyBrain Injury,EBI)概念,即從SAH開始至72小時(shí)這一時(shí)間窗之內(nèi)的腦損傷。EBI是一個(gè)非常復(fù)雜的病理生理過(guò)程,所涉及的分子機(jī)制十分復(fù)雜,包括炎癥因子的釋放、氧化應(yīng)激的產(chǎn)生、谷氨酸的毒性作用、脂質(zhì)過(guò)氧化、鈣離子通道的開放、細(xì)胞凋亡或壞死等。截止目前,大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),神經(jīng)細(xì)胞死亡和神經(jīng)炎癥反應(yīng)是EBI的兩大主要損傷機(jī)制。
褪黑素是一種由松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素,易滲透
3、血腦屏障(Blood BrainBarrier,BBB),具有良好的生物耐受性。近年來(lái),褪黑素逐漸被證明可以通過(guò)減少氧化應(yīng)激,抑制炎癥反應(yīng),激活自噬和抑制凋亡等多種機(jī)制在SAH疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而,這其中涉及的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。
因此,本研究將從抑制EBI兩大主要損傷機(jī)制,即抗細(xì)胞死亡及抗神經(jīng)炎癥兩個(gè)方面對(duì)褪黑素在SAH中的保護(hù)機(jī)制展開研究。第一部分研究將著眼于壞死性凋亡這種新型的細(xì)胞死亡方式,觀察壞死性凋
4、亡機(jī)制是否參與了SAH的致病過(guò)程,并且進(jìn)一步探討褪黑素治療對(duì)于壞死性凋亡的作用及其可能機(jī)制。第二部分研究主要著眼于褪黑素調(diào)控NLRP3炎癥小體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。
方法:
第一部分
1.采用線栓穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)模型,成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)被分為假手術(shù)組(Sham組)和蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH組)。SAH組按取材時(shí)間不同又分為蛛網(wǎng)膜下腔出血后6h組(SAH6
5、h組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血后12h組(SAH12h組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h組(SAH24h組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血48h組(SAH48h組)和蛛網(wǎng)膜下腔出血后72h組(SAH72h組),通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)各組SD大鼠同側(cè)大腦皮質(zhì)內(nèi)RIPK3蛋白含量;通過(guò)雙重免疫熒光染色觀察RIPK3的細(xì)胞定位;通過(guò)碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色鑒定壞死神經(jīng)細(xì)胞及其與RIPK3的關(guān)系;通過(guò)透射電子顯微鏡(Transmission
6、ElectronMicroscope,TEM)觀察壞死神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。
2.成年雄性SD大鼠隨機(jī)被分為假手術(shù)+溶劑組(Sham組),蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組(SAH+溶劑組),蛛網(wǎng)膜下腔出血+GSK872處理組(SAH+GSK872組),根據(jù)各分組不同的藥物治療情況,SAH模型建立后30分鐘,應(yīng)用立體定位下側(cè)腦室注射法分別給予溶劑或RIPK3抑制劑GSK872,SAH后72小時(shí)通過(guò)免疫熒光等方法評(píng)估各組的細(xì)胞死亡,腦水腫
7、和神經(jīng)功能等情況。
3.成年雄性SD大鼠隨機(jī)被分為假手術(shù)+溶劑組(Sham組),蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組(SAH+溶劑組),蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素處理組(SAH+Mel組),根據(jù)各分組不同的藥物治療情況,SAH模型建立后2小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí),分別給予溶劑或褪黑素腹腔注射,SAH后72小時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光等方法評(píng)估各組相關(guān)蛋白的表達(dá),細(xì)胞死亡,腦水腫和神經(jīng)功能等情況。
4.成年雄性SD大鼠隨機(jī)被分為蛛網(wǎng)
8、膜下腔出血+溶劑組(SAH+溶劑組),蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素處理組(SAH+Mel組),蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素+3-MA處理組(SAH+Mel+3-MA組),根據(jù)各分組不同的藥物治療情況,SAH模型建立前20分鐘,給予腦室內(nèi)注射溶劑或3-MA,術(shù)后2小時(shí),24小時(shí)和48小時(shí),給予溶劑或褪黑素腹腔注射,SAH后72小時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光等方法評(píng)估各組相關(guān)蛋白的表達(dá),細(xì)胞死亡,腦水腫和神經(jīng)功能等情況。
第二部分
9、 采用線栓穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)模型,成年雄性SD大鼠隨機(jī)被分為假手術(shù)+溶劑組(Sham組),蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組(SAH+溶劑組),蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素處理組(SAH+Mel組)和蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素+3-MA處理組(SAH+Mel+3-MA組),根據(jù)各分組不同的標(biāo)準(zhǔn),SAH模型建立前20分鐘,給予腦室內(nèi)注射溶劑或3-MA,術(shù)后2小時(shí)給予溶劑或褪黑素腹腔注射。24小時(shí)后獲取大腦標(biāo)本,通過(guò)腦含水量檢測(cè)、活性氧測(cè)定、蛋白
10、免疫印跡、免疫組織化學(xué)和透射電子顯微鏡等方法檢測(cè)線粒體自噬、NLRP3炎癥小體等相關(guān)指標(biāo)。
結(jié)果:
第一部分
1.SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后6個(gè)小時(shí),腦組織中RIPK3的表達(dá)升高,12小時(shí)出現(xiàn)一個(gè)較小幅度的下降,接著再度上升,在72小時(shí)到達(dá)峰值。
2.通過(guò)PI染色及透射電鏡觀察到大鼠腦組織在蛛網(wǎng)膜下腔出血后72小時(shí)出現(xiàn)壞死的神經(jīng)元,且RIPK3主要位于神經(jīng)元中。
3.褪黑素能降低RIPK3
11、和MLKL的表達(dá),并減少壞死神經(jīng)元的數(shù)量及HMGB1的釋放。褪黑素能通過(guò)減少血腦屏障的破壞而減輕水腫,從而能夠在蛛網(wǎng)膜下腔出血72小時(shí)后改善神經(jīng)功能。
4.自噬抑制劑3-MA能逆轉(zhuǎn)褪黑素對(duì)于緩解RIPK-3介導(dǎo)的壞死性凋亡的作用。
第二部分
1.SAH后褪黑素治療上調(diào)線粒體自噬相關(guān)蛋白(PINK1/Parkin),減輕線粒體損傷,減少ROS產(chǎn)生。
2.SAH后褪黑素治療抑制NLRP3炎癥小體激活,
12、減少炎癥反應(yīng)。
3.SAH后褪黑素治療減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡,減輕腦水腫和緩解神經(jīng)功能障礙。
4.自噬抑制劑3-MA預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)褪黑素治療對(duì)于NLRP3炎癥小體活化的抑制作用。
結(jié)論:
1.本研究證實(shí)RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡與SAH的早期腦損傷有關(guān)。褪黑素能減輕RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡,減少HMGB1胞漿易位、保護(hù)血腦屏障及減輕腦水腫,從而改善SAH后的神經(jīng)功能。而這其中潛在的機(jī)制可能與自噬的激活
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