運脾開胃方對厭食癥大鼠Ghrelin、VIP信號通路干預(yù)與物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:研究運脾開胃方對厭食癥大鼠血清、胃竇、空腸部Ghrelin、VIP水平及其下游信號蛋白的表達影響，明確運脾開胃方對Ghrelin、VIP信號通路的干預(yù)作用;探究運脾開胃方中存在的化學(xué)成分，明確其在治療厭食癥質(zhì)量方面的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法:1.用特制飼料建立厭食癥的大鼠模型，使用運脾開胃方治療，觀察大鼠的食欲、體重變化觀察情況。2.檢測大鼠血清、胃腸道中VIP、Ghrelin水平;檢測胃腸道中VIP、Ghrelin受體及其下游

2、信號蛋白的表達及磷酸化水平。3.用運脾開胃含藥血清刺激HGSMC，觀測細胞內(nèi)Ca+水平的變化情況，檢測細胞內(nèi)IP3R、PKC、MLC及其磷酸化水平。4.運用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析運脾開胃方的單體化學(xué)成分。5.用Ghrelin受體抑制劑阻斷人胃竇平滑肌細胞HGSMC上的GHSR，用取得的化學(xué)成分刺激HGSMC，觀測細胞內(nèi)Ca2+、MLC及其磷酸化水平變化情況。6.選擇對HGSMC內(nèi)Ga2+有干預(yù)作用的化學(xué)單體成分給小鼠口服灌胃，同

3、時予以Ghrelin受體抑制劑阻斷小鼠體內(nèi)的GHSR，檢測小鼠胃排空的變化情況及小鼠胃部MLC及其磷酸化水平的變化。
　　結(jié)果:1.經(jīng)特制飼料喂養(yǎng)8周后，各組雌、雄大鼠進食量、體重均出現(xiàn)顯著下降，出現(xiàn)顯著厭食癥癥狀(P＜0.05或0.01)。經(jīng)運脾開胃方治療4-6周后，低、中劑量組大鼠進食量明顯升高和模型組、自然恢復(fù)組出現(xiàn)顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05或0.01)，但高劑量組和模型組、自然恢復(fù)組相比未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。給

4、藥6周后，低、中、高劑量雄性大鼠體重和模型組、自然恢復(fù)組相比出現(xiàn)顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05或0.01)。但雌性大鼠的體重只有低、中劑量組和模型組、自然恢復(fù)組相比出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05或0.01)，高劑量組只和自然恢復(fù)組出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2.運脾開胃方可以顯著提高厭食癥大鼠血清中Ghrelin水平，以中劑量組最為明顯，和空白組、模型組、自然恢復(fù)組相比均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，其次為低劑量組。經(jīng)運

5、脾開胃方干預(yù)后，低、中劑量組大鼠胃竇部Ghrelin水平顯著升高并具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而高劑量組大鼠胃竇部Ghrelin水平只和模型組相比有明顯上升(P＜0.05)。和空白組、模型組相比，運脾開胃高劑量組空腸Ghrelin水平明顯上升具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05或0.01)，低、中劑量組只和模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。和空白組、模型組、自然恢復(fù)組相比，經(jīng)各劑量的運脾開胃方干預(yù)后大鼠胃竇部GHSR水平未見明顯

6、變化(P＞0.05);運脾開胃低、高劑量組大鼠胃竇部p-IP3R出現(xiàn)顯著升高，和空白組、模型組、自然恢復(fù)組相比均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);低、中、高組大鼠胃竇部p-PKC水平較模型組、自然恢復(fù)相比均出現(xiàn)顯著升高(P＜0.01);經(jīng)運脾開胃方干預(yù)后，只有中劑量組大鼠胃竇部的p-MLC水平出現(xiàn)了顯著的上調(diào)，和空白組、模型組、自然恢復(fù)組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。經(jīng)低、中劑量的運脾開胃方干預(yù)后，厭食癥大鼠空腸部GHSR未見明顯

7、變化(P＞0.05);經(jīng)運脾開胃方干預(yù)后，低、中劑量組大鼠空腸部p-IP3R較模型組、空白組出現(xiàn)顯著升高趨勢(P＜0.01)，但是自然恢復(fù)組p-IP3R水平較模型組也同樣出現(xiàn)顯著的上調(diào)趨勢(P＜0.01);經(jīng)運脾開胃方各劑量干預(yù)后，低、中、高組大鼠胃竇部p-PKC水平較模型組、自然恢復(fù)相比均出現(xiàn)顯著升高的趨勢(P＜0.01);和其他各組相比，模型組p-MLC表達明顯降低，且具有不同程度的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01或P＜0.05)。

8、　　3.經(jīng)各劑量運脾開胃方治療后，低、中、高劑量組厭食癥大鼠的VIP水平出現(xiàn)一定程度的上升，但是只有高劑量組的VIP水平出現(xiàn)明顯的上調(diào)，和空白組、模型組、自然恢復(fù)組相比出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。低、中、高劑量組和空白組大鼠胃竇、空腸部VIP水雖出現(xiàn)了一定程度的升高，但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。經(jīng)運脾開胃方低、中、高劑量組干預(yù)后厭食癥大鼠胃竇部VPAC2水平顯著升高(P＜0.01);低、中、高劑量組大鼠胃竇部p-PKA均出現(xiàn)

9、了顯著的上調(diào)趨勢，但是和空白組相比只有高劑量組體現(xiàn)出了顯著提高趨勢(P＜0.01);和模型組、自然恢復(fù)組相比，經(jīng)運脾開胃方干預(yù)后低、中劑量組厭食癥大鼠胃竇部p-eNOS水平明顯升高，且具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而低劑量組p-eNOS表達水平卻未見明顯變化(P＞0.05)。和模型組、自然恢復(fù)組相比，經(jīng)運脾開胃方低、中、高劑量組干預(yù)后厭食癥大鼠胃竇部VPAC2水平顯著升高(P＜0.01);和模型組、自然恢復(fù)組相比，經(jīng)運脾開胃方干預(yù)

10、后，低、中、高劑量組大鼠胃竇部p-PKA均出現(xiàn)了顯著的上調(diào)趨勢(P＜0.05或0.01)，但是和空白組相比卻體現(xiàn)出了顯著下降趨勢(P＜0.01)。和模型組、自然恢復(fù)組相比，經(jīng)運脾開胃方干預(yù)后只有低劑量組厭食癥大鼠胃竇部p-eNOS水平明顯升高，且具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。
　　4.運脾開胃含藥血清中、高劑量組能在10-40s時間段內(nèi)顯著提升HGSMCs內(nèi)的Ca2+熒光強度(P＜0.01)，低劑量組運脾開胃含藥血

11、清刺激HGSMCs20s后相對熒光強度開始出現(xiàn)顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），持續(xù)20s。運脾開胃含藥血清刺激10、20 min后可以顯著上調(diào)p-IP3R水平且具有明顯的量效依賴關(guān)系;運脾開胃各劑量組含藥血清刺激HGSMCs10min后，可見HGSMCs內(nèi)p-PKC、p-MLC水平顯著上升(P＜0.01或0.05)且具有明顯的量效依賴關(guān)系，其余時段運脾開胃各組p-PKC、p-MLC水平雖然也有一定程度的上升，但是上調(diào)的程度不及10min

12、。(D-Lys3)-GHRP-6能顯著抑制運脾開胃含藥血清對p-IP3R、p-PKC、p-MLC的上調(diào)作用且具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);D-HBSS和Thapsigargin能顯著抑制運脾開胃含藥血清對p-IP3R、p-MLC的上調(diào)作用(P＜0.01)，但是卻不能抑制運脾開胃含藥血清對p-PKC的上調(diào)作用。
　　5.UPLC-LTQ-Qrbitrap色譜圖和質(zhì)譜結(jié)果顯示，運脾開胃方中存在蘆丁、牡荊素、柚皮苷、橙皮苷、川陳皮

13、素、桔皮素、蒼術(shù)素、綠原酸、金絲桃苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素12個化學(xué)單體成分，分別來自于陳皮、山楂和蒼術(shù)，未發(fā)現(xiàn)來源于雞內(nèi)金的成分。
　　6.在運脾開胃12個化學(xué)單體成分中，只有柚皮苷、蒼術(shù)素引起的Ca2+內(nèi)流能被(D-Lys3)-GHRP-6所阻斷。蒼術(shù)素在10 min左右可以顯著提高p-MLC水平，同時具有明顯的量效依賴關(guān)系(P＜0.01)。(D-Lys3)-GHRP-6、D-HBSS和Thapsigargin均能抑制蒼術(shù)

14、素對HGSMCs內(nèi)p-MLC的上調(diào)作用。蒼術(shù)素可以顯著提高昆明小鼠的胃排空率，但是只有蒼術(shù)素中、高劑量組的升高具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或0.01)，而低、中、高劑量的蒼術(shù)素還能上調(diào)小鼠胃竇部的p-MLC水平(P＜0.05或0.01);在使用(D-Lys3)-GHRP-6對小鼠腹腔進行注射后，蒼術(shù)素對小鼠的促胃排空和上調(diào)胃竇部p-MLC水平的能力均被明顯抑制(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1.運脾開胃方可以顯著改善成年厭食癥大鼠進

15、食減少和體重減輕的癥狀，對大鼠厭食癥有著非常顯著的療效。
　　2.低、中、高劑量的運脾開胃方可以顯著上調(diào)厭食癥大鼠血清和胃竇部Ghrelin的水平，對大鼠胃竇、空腸部的p-IP3R、p-PKC、p-MLC有不同程度的上調(diào)的作用，對厭食癥大鼠的胃腸運動有顯著的促進作用。
　　3.運脾開胃方各劑量組能不同程度上調(diào)厭食癥大鼠胃竇、空腸部VIP下游p-PKA、p-eNOS水平，促進胃腸道平滑肌的容受性舒張，其機制可能和上調(diào)VIP受體

16、VPAC2有關(guān)。
　　4.運脾開胃含藥血清能顯著上調(diào)HGSMCs中p-IP3R、p-PKC、p-MLC水平，其機制與促進細胞內(nèi)Ca2+釋放和激活Ghrelin受體GHSR有關(guān)。
　　5.UPLC-LTQ-Qrbitrap技術(shù)顯示運脾開胃方的水提物中存在蘆丁、牡荊素、柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、蒼術(shù)素、綠原酸、金絲桃苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素這12個化學(xué)單體成分，可能為運脾開胃方的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　6.在運