我國部分咸水源中弗朗西斯菌的分離和特征研究.pdf

1、目的:
　　對環(huán)境水樣進(jìn)行弗朗西斯菌的分離和培養(yǎng)，完成疑似菌株的鑒定，初步確定分離株的分類學(xué)地位，并對分離株進(jìn)行微生物學(xué)特征研究，為臨床上鑒別弗朗西斯菌提供依據(jù)。
　　方法:
　　(1)水樣分離:采用濃縮酸處理法和BCYE-GVPCC抗生素平板進(jìn)行水樣分離，挑取平板上灰白色、半透明菌落進(jìn)行初步鑒定。
　　(2)初步鑒定:對弗朗西斯菌疑似分離株進(jìn)行觸酶試驗和革蘭染色鏡檢;對觸酶弱陽性和鏡下呈革蘭陰性、細(xì)砂狀球桿菌狀

2、的疑似分離株進(jìn)行16S rRNA基因擴增和序列分析，初步確定分離株的分類學(xué)地位。
　　(3)多項分類學(xué)研究:對分離株進(jìn)行多項分類學(xué)研究，包括:16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析、管家基因(sdhA基因、rpoB基因、mdh基因)特征、表型特征和生理生化特征(API ZYM試劑盒、Rapid ID32 A試劑盒、API NH試劑盒、藥敏試驗、基因組DNA(G+C) mol％、全細(xì)胞脂肪酸、醌類型、磷酸類脂、最適生長溫度試驗、毒力試驗等

3、）。
　　(4)弗朗西斯菌的特征分析:綜合分析弗朗西斯菌的微生物學(xué)特征，并與臨床上近似的革蘭陰性菌相鑒別。
　　結(jié)果:
　　(1)水樣分離:收集到來自咸水源的184份環(huán)境水樣，其中陽性水樣為15份，水樣陽性率為8.15％。
　　(2)疑似菌株的初步鑒定:分離出10株觸酶弱陽性、鏡下呈細(xì)砂狀革蘭陰性球桿菌的疑似菌株（除外6株未能成功保存的菌株），包括環(huán)境水樣疑似分離株9株:其中8株（QH-2、QH-3、QH-4、Q

4、H-5、QH-12、QH-15、HN-3、YJ-2）初步鑒定為蜃樓弗朗西斯，1株(D3-2)初步鑒定為新屬菌株;溫州溺水性肺炎患者血液疑似分離株1株(WZ-1)，初步鑒定為新兇手樣弗朗西斯菌。
　　(3)多項分類學(xué)研究:
　?、?6S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析:8株疑似菌株（QH-2、QH-3、QH-4、QH-5、QH-12、QH-15、HN-3、YJ-2）與蜃樓弗朗西斯菌模式菌株25015、25017位于同一分支;WZ-1

5、分離株與新兇手弗朗西斯菌、土拉熱弗朗西斯菌位于同一分支;D3-2獨樹一幟，與所有已知的弗朗西斯菌的親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。
　?、诠芗一蛱卣?分離株均擴增到長度約300bp的sdhA基因DNA片段，330bp的rpoB基因DNA片段，750bp的mdh基因DNA片段(D3-2分離株除外)。
　?、郾硇吞卣?分離株在BCYEα平板和嗜血巧克力平板上生長良好，血平板上生長緩慢，具有L-半胱氨酸依賴性，呈扁平狀、灰白色、半透明菌落;鏡下

6、呈細(xì)砂狀革蘭陰性球桿菌，無鞭毛，無動力。
　　④生理生化特征:分離株觸酶試驗弱陽性，氧化酶試驗陽性，吲哚試驗陰性(WZ-1除外);特征性酶包括堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、精氨酸芳香基酶、丙氨酸芳香基酶、組氨酸芳香基酶、青霉素酶、葡萄糖（產(chǎn)酸）、果糖（產(chǎn)酸）、蔗糖（產(chǎn)酸）等;對慶大霉素、四環(huán)素、強力霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素等均為敏感;WZ-1分離株基因組DNA(G+

7、C) mol％為33.30％，D3-2分離株為38.00％; WZ-1分離株全細(xì)胞脂肪酸主要為C10∶0(16.75％)、C14∶0(9.79％)、C16∶0(18.87％)、C16∶03-OH(8.89％)和C18∶1ω9c(11.16％)，這五項脂肪酸占細(xì)胞總脂肪酸的65.46％，D3-2分離株主要為C16∶0(5.38％)、C18∶0(20.43％)、anteiso-C15∶0(34.40％)、iso-C16∶0(5.92％)、a

8、nteiso-C17∶0(10.73％)，此五項脂肪酸占細(xì)胞總脂肪酸的76.86％; WZ-1分離株醌類型為Q8(66.89％)和Q9(33.11％)，D3-2分離株為Q8(100％); WZ-1分離株的主要磷酸類脂為DPG、PE、PG、PC、PL1、ALP2、UL，D3-2分離株為PL、DPG、PE、PG、PC、ALP、AL; WZ-1分離株的毒力預(yù)實驗顯示其LD50為107CFU/mL，LD100為109CFU/mL，由于試驗條件限

9、制，未能完成毒力實驗;WZ-1分離株和D3-2分離株最適生長溫度均為35℃，42℃不生長。
　?、軩3-2分離株擬命名為:球桿菌屬，海岸球桿菌(Coccodibacter litoralis);WZ-1分離株擬命名為:弗朗西斯菌屬，溫州弗朗西斯菌(Francisella wenzhouensis)。
　　(4)弗朗西斯菌在平板上呈扁平狀、灰白色、半透明菌落，生長不需要X/V因子，但L-半胱氨酸有促進(jìn)細(xì)菌生長的作用;鏡下呈細(xì)砂

10、狀的革蘭陰性球桿菌，無鞭毛，無動力;氧化酶陽性，觸酶弱陽性，吲哚試驗陰性;基因組DNA(G+C) mol％特征為32％～34％;脂肪酸特征為具有偶鏈飽和脂肪酸（C10∶0，C14∶0和C16∶0）和兩個長鏈羥基酸（C16∶03-OH和C18∶03-OH）;醌類型特征為以Q8為主;磷酸類脂特征為DPG、PG、PC、PE、PL1、PL2、PL3、APL2、APL3。臨床上相近似的革蘭陰性菌包括:布魯菌、巴爾通體屬、不動桿菌屬、嗜血桿菌、鼠疫