土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌定量PCR檢測技術的研究.pdf

1、目的：土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis, FT)和炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis, BA)具有高致病性，是重要的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑，給人類的健康構成了嚴重威脅，因此有必要建立一種快速、可靠的檢測這兩種細菌的方法。
　　 方法：本研究基于TaqMan熒光探針定量PCR技術，建立并優(yōu)化定量PCR檢測體系，針對特異的染色體序列Aldo/keto reductase醇醛酮還原酶基因(AK

2、R基因)和外膜蛋白基因(fopA)設計引物及探針，檢測土拉弗朗西斯氏菌；針對位于兩個毒力相關質粒上的莢膜因子（capA）和致死因子基因（lef）以及染色體上的特異序列(GS)設計多對引物及探針，聯合檢測炭疽芽孢桿菌。選擇基因組同源性高的菌種DNA作為模板，評價該檢測體系的特異性；采用克隆株或減毒株以及強毒株基因組DNA作為模板，評價該檢測體系的靈敏度。利用克隆株或減毒株污染環(huán)境土壤制備模擬樣品，評價該檢測體系在快速檢測與現場檢測等實際應

3、用中的表現。分別采用重組質粒、克隆株或減毒株以及模擬污染水樣本為模板，在上海消防特勤支隊的進口消防多功能偵檢車上，與進口熒光定量PCR試劑進行平行比對檢測試驗，評價該檢測體系的準確率與檢出率。
　　 結果：(1)優(yōu)化篩選出土拉弗朗西斯氏菌染色體上的FT-AKR和FT-fopA片段作為檢測靶序列，建立了TaqMan熒光定量PCR快速檢測鑒定土拉弗朗西斯氏菌的反應體系及條件，以其他非土拉弗朗西斯氏菌菌種為模板未出現非特異擴增；檢測克

4、隆株質粒的靈敏度均為每個反應體系10拷貝；以土拉弗朗西斯氏菌基因組DNA作為模板的靈敏度試驗，AKR-F/R引物對檢測靈敏度可以達到0.25pg/μl; fopA-F/R引物對檢測靈敏度是2.5pg/μl;用克隆株模擬環(huán)境土壤樣本，兩個引物對的檢測靈敏度分別為440和960CFU/g土壤；盲測實驗結果顯示對于靈敏度范圍內的陽性樣本均能正確識別，并且能夠正確檢測出不同濃度的陽性樣本。本檢測體系與進口熒光定量PCR試劑對比檢測試驗結果顯示：

5、4份不同濃度的陽性樣本與2份陰性樣本均能正確識別；模擬6份污染水樣本檢出率100％，進口試劑陽性漏檢1份。(2)優(yōu)化篩選出炭疽芽孢桿菌基因組特異序列GS序列和pXOl質粒的lef基因、pX02質粒的capA基因作為檢測靶序列，建立了TaqMan熒光定量PCR快速檢測鑒定炭疽芽孢桿菌的反應體系及條件，以其他非炭疽芽孢桿菌菌種為模板未出現非特異擴增；以BA-lef.BA-capA和BA-GS克隆株提取的質粒DNA作為模板，capA-F/R和

6、GS-F/R引物對檢測靈敏度為每個反應體系10拷貝，lef-FIR引物對為每個反應體系102拷貝；以炭疽芽孢桿菌Sterne菌株作為模板，lef-F/R和GS-F/R引物對檢測靈敏度為1.2xl0-2 CFU/μl:以炭疽芽孢桿菌基因組DNA作為模板，lef-F/R引物對檢測靈敏度可以達到2.4fg/μl；CapA-F/R引物對檢測靈敏度是24fg/μl: GS-F/R引物對檢測靈敏度是0.24pg/μl:用炭疽芽孢桿菌Sterne菌株

7、芽孢模擬環(huán)境土壤樣本，lefF/R和GS-F/R引物對的檢測靈敏度可達2x103 CFU/g土壤；盲測實驗結果顯示對于靈敏度范圍內的陽性樣本均能正確識別，并且能夠正確檢測出不同濃度的陽性樣本。本檢測體系與進口熒光定量PCR試劑對比檢測試驗結果顯示：4份不同濃度的陽性樣本與2份陰性樣本均能正確識別；模擬6份污染水樣本檢出率100%，與進口試劑檢出率持平。
　　 結論：本研究建立的土拉弗朗西斯氏菌和炭疽芽孢桿菌的檢測鑒定體系，方法簡