RBFOX2基因組范圍內(nèi)招募RPC2和調(diào)節(jié)H3K27me3修飾的分子機制研究.pdf

1、Polycomb Repressive Complex2(PRC2)是具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的復(fù)合物，可以通過催化H3K27me3修飾來抑制基因轉(zhuǎn)錄活性。關(guān)于PRC2如何被招募到染色質(zhì)特定區(qū)域的研究尚存在許多爭議，是目前表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的熱點和難點之一。最新的生化實驗證明PRC2可以混亂結(jié)合RNA，另外細(xì)胞內(nèi)數(shù)據(jù)也表明PRC2亞基可以結(jié)合處于適量表達(dá)水平的mRNA，并且更傾向于結(jié)合5‘端區(qū)域。因此研究者提出PRC2可以通過結(jié)合新生R

2、NA（Nascent RNA）被招募到染色質(zhì)基因啟動子區(qū)域。RNA結(jié)合蛋白FOX2（RBFOX2）是廣泛存在于多種組織和細(xì)胞中的剪切因子，該蛋白對神經(jīng)、心肌和骨骼肌系統(tǒng)正常發(fā)育和功能維持具有十分重要的功能。本組之前研究表明RBFOX2除了具有剪切調(diào)節(jié)功能外，還具有抑制基因轉(zhuǎn)錄活性的作用。本文經(jīng)過一列實驗研究，證明RBFOX2可以通過招募PRC2來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，并且在胚胎干細(xì)胞（ESCs）中該招募過程受到ERK1/2通路的調(diào)節(jié)。本論文

3、主要包括以下實驗結(jié)果：
　?、?RBFOX2 ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示 RBFOX2主要結(jié)合基因轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)；經(jīng)比對分析后發(fā)現(xiàn)RBFOX2和PRC2亞基SUZ12結(jié)合位點十分接近，并且RBFOX2信號聚集峰值和SUZ12峰值也高度重合。另一方面，通過特異基因誘導(dǎo)表達(dá)模型發(fā)現(xiàn)RBFXO2是通過轉(zhuǎn)錄激活產(chǎn)生的新生RNA招募到基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。
　?、诿庖吖渤恋韺嶒?Co-IP)證明RBFOX2和PRC2可以不依賴RNA

4、或DNA直接蛋白-蛋白相互作用。體外GST-Pulldown也同樣證明RBFOX2可以捕獲整個PRC2，并且RBFOX2的C端區(qū)域同PRC2相互作用。
　?、?ESCs在常規(guī)培養(yǎng)體系下，RBFox2基因沉默會引起整個基因組啟動子區(qū)域H3K27me3修飾降低；但是在“2i”（ERK1/2通路抑制劑PD0325901和GSK3抑制劑 CHIR99021）培養(yǎng)體系下，RBFox2沉默不會引起啟動子區(qū)域 H3K27me3修飾變化。

5、　?、?RBFOX2具有兩個主要的剪切變異體，分別命名為RBFOX2a和RBFOX2f，不同細(xì)胞中主要的剪切變異體不同。并且在干細(xì)胞分化過程中會出現(xiàn)主要剪切變異體從RBFOX2a向RBFOX2f轉(zhuǎn)變的過程。另外，ERK1/2信號通路激活可以磷酸化RBFOX2a，不能磷酸化RBFOX2f。
　?、?RBFOX2磷酸化修飾不會改變自身的亞細(xì)胞定位，也不能改變同PRC2的相互作用能力。但是 RBFOX2磷酸化修飾會改變自身 RNA結(jié)合能

6、力和特異性剪切調(diào)節(jié)能力。
　　通過以上結(jié)果，對新生RNA介導(dǎo)的PRC2招募方式進(jìn)行改進(jìn)，得出新的PRC2招募模型：啟動子區(qū)域新生RNA捕獲RBFOX2蛋白，RBFOX2通過蛋白-蛋白相互作用招募PRC2到基因啟動子區(qū)域。當(dāng)該基因轉(zhuǎn)錄活性較高，轉(zhuǎn)錄激活標(biāo)記H3K4me3和H3K36me3會抑制PRC2染色質(zhì)結(jié)合及催化活性，PRC2無法催化H3K27me3修飾；當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄活性適中或較低，PRC2活性不會被抑制，可以催化H3K27me修

7、飾，防止這些基因過度激活。在這個模型中，編碼基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA除了翻譯蛋白發(fā)揮功能外，還可以作為自身轉(zhuǎn)錄活性的信號，通過招募其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白來維持局部轉(zhuǎn)錄活性穩(wěn)定。另一方面，ESCs在“2i”培養(yǎng)體系下會處于更加原始狀態(tài)（Naive）狀態(tài)，并且基因組范圍內(nèi)啟動子區(qū)域H3K27me3修飾水平更低。認(rèn)為ERK1/2通路抑制劑可以使RBFOX2去磷酸化改變其RNA結(jié)合能力，進(jìn)而降低PRC2招募能力，這一途徑是ESCs在原始狀態(tài)下具有非常低