一種基于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組合原理構(gòu)建突變體文庫方法的研究.pdf

1、酶的定向進(jìn)化是改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)滿足工業(yè)化需求的有效途徑，現(xiàn)在定向進(jìn)化技術(shù)已被用于上百個酶的進(jìn)化，大大提高了生物酶的活性和效率，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生物制藥等方面產(chǎn)生了巨大影響。酶的定向進(jìn)化的成功與否主要取決于所構(gòu)建的突變文庫是否具有足夠大的多樣性及庫容量。以易錯PCR為代表的隨機(jī)突變技術(shù)和以DNA改組技術(shù)為代表的DNA重組技術(shù)是目前常用的兩種定向進(jìn)化技術(shù)。
　　針對現(xiàn)有的構(gòu)建文庫方法的缺點(diǎn)，本論文設(shè)計了一種基于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組合原理構(gòu)

2、建突變體文庫的新方法。以原有蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)單元為模塊進(jìn)行重組，相較于現(xiàn)有的文庫構(gòu)建方法，本方法模塊重組多樣性高，且并未破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能單元，形成有功能突變體的幾率較高。為便于篩選，以卡那霉素抗性基因作為實(shí)驗(yàn)對象。首先分析同源性低的卡那霉素抗性蛋白的結(jié)構(gòu)功能信息，選取其二級結(jié)構(gòu)及重要催化活性中心區(qū)域?yàn)榛窘M合模塊。以A-T連接及酶切產(chǎn)生粘性末端連接兩種方法構(gòu)建突變體文庫。最終，利用本方法篩選得到了10個有效突變體，最高抗性達(dá)到192