一種基于構件重組原理構建基因文庫方法的研究.pdf

1、酶的定向進化能夠取得成功的兩個關鍵是建立多樣性突變庫和有高效的篩選系統(tǒng)。本文利用agaB基因在表達時可以水解瓊脂糖的特性構建了一種高效率的組成型表達篩選載體:基于構建重組的原理利用共用接頭互補重聚構建了一個大容量的基因文庫。
　　 1.利用穩(wěn)定性和轉化效率高的pBluescriptⅡ KS(+)克隆載體質粒作為構建載體的母核,插入agaB啟動子構建組成型表達載體,并利用pET-24a(+)上的酶切位點對表達載體上的酶切位點進行改

2、造,再插入agaB基因構建組成型篩選載體。由于agaB基因表達時能在固體LB培養(yǎng)基上產生水解圈,雙酶切后的載體連接目的片段在固體LB培養(yǎng)基上進行表達時,有水解圈的即為雙酶切不完全的假陽性克隆,而沒有水解圈的單克隆為插入了目的基因的陽性克隆。利用卡那霉素抗性基因檢驗篩選載體的效果。經(jīng)實驗驗證,篩選效率達到90％以上,比傳統(tǒng)載體篩選效率高很多,且不需要藍白斑篩選,簡化了實驗步驟,減少了實驗成本。
　　 2.大容量基因文庫的構建:首先

3、設計長度為21個堿基的兩條隨機序列,作為實驗組合的基本模塊,并在隨機序列的兩端分別設計九個堿基,這九個堿基順向互補,作為一個通用的連接接頭,在PCR重聚時相互作為引物。選用的九個堿基是可編碼形成柔性氨基酸(linker)的堿基序列。隨機序列中間的21個堿基是隨機的,編碼7個氨基酸,達到形成一個蛋白模序(motif)所需要的氨基酸數(shù)目。因此,隨機序列通過PCR重聚就可以得到一個能夠編碼多種蛋白質的一個隨機基因文庫。在重聚過程中,為了防止重