金黃色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa在骨髓炎的作用研究.pdf

1、目的:骨髓炎是骨科的常見病和多發(fā)病，是骨組織受到細(xì)菌引起的骨髓腔、骨和骨膜及周圍組織的急性或慢性炎癥過程。金黃色葡萄球菌是骨髓炎主要的致病菌，占所有骨髓炎病例的80％。金黃色葡萄球菌的致病性是一個(gè)復(fù)雜的過程，其致病性的強(qiáng)弱取決于所產(chǎn)生的毒素和酶。殺白細(xì)胞素(PVL)是金黃色葡萄球菌分泌的一種特有的外毒素，屬于雙組份毒素家族的成員，由LukS-PV和LukF-PV組成。PVL通過在細(xì)胞膜上形成穿膜孔殺傷白細(xì)胞。很多研究顯示PVL在金黃色葡

2、萄球菌所致的壞死性皮膚損害和壞死性肺炎等疾病起重要作用。葡萄球菌A蛋白(SpA)是葡萄球菌細(xì)胞壁的一種表面蛋白，可與多種哺乳動(dòng)物IgG的Fc結(jié)合，具有抗吞噬，促細(xì)胞分裂，引起超敏反應(yīng)、損傷血小板等多種生物學(xué)活性。凝固酶(Coa)是金黃色葡萄球菌的重要致病因子，具有保護(hù)病原菌不被宿主細(xì)胞吞噬和避免抗體結(jié)合的作用。雖然PVL，SpA和Coa已經(jīng)被證實(shí)是金黃色葡萄球菌的重要致病因子，但是三者在金黃色葡萄球菌引起骨感染導(dǎo)致骨髓炎的作用仍不清楚。

3、因此，本課題通過構(gòu)建金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SpA和Coa的過表達(dá)質(zhì)粒和基因刪除質(zhì)粒，運(yùn)用各種檢測(cè)手段和方法觀察這三者對(duì)成骨細(xì)胞增殖和凋亡，骨代謝和分化以及核因子-κB受體活化因子配體（RANK-L）的影響，探討金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SpA和Coa在骨髓炎中的作用及可能的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:1）采用RT-PCR技術(shù)和酶切-連接克隆方法構(gòu)建PVL、SpA和Coa表達(dá)質(zhì)粒，利用同源重組構(gòu)建PVL、SpA和Coa基因刪除

4、質(zhì)粒，并利用電轉(zhuǎn)將基因刪除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌，通過溫度和紅霉素抗性壓力篩選金黃色葡萄球菌PVL，SpA和Coa基因缺失突變株;2）運(yùn)用MTT法和AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)觀察PVL，SpA和Coa對(duì)成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并利用western blot觀察金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SpA和Coa對(duì)成骨細(xì)胞中caspase-3和caspase-9活性的影響;3）利用分別轉(zhuǎn)染PVL，SpA和Coa表達(dá)質(zhì)?；蚧?/p>

5、因刪除質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染MC3T3-E1細(xì)胞，運(yùn)用RT-PCR方法觀察PVL，SpA和Coa對(duì)Ⅰ型膠原(collagenⅠ)、骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OC)mRNA表達(dá)水平的影響;4）轉(zhuǎn)染PVL、SpA和Coa表達(dá)質(zhì)?；蚧騽h除質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染MC3T3-E1細(xì)胞后，利用茜素紅法和von kossa法觀察骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)情況，并利用堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒觀察ALP的活性;5）利用分別轉(zhuǎn)染PVL、SpA和Co

6、a表達(dá)質(zhì)粒或基因刪除質(zhì)粒不同質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染MC3T3-E1細(xì)胞，運(yùn)用ELISA方法觀察PVL，SpA和Coa對(duì)細(xì)胞中RANK-L表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:1）采用DNA重組技術(shù)和同源重組，成功構(gòu)建金黃色葡萄球菌毒力因子PVL、SpA和Coa表達(dá)質(zhì)粒pMD19-T-PVL、pMD19-T-SpA和pMD19-T-Coa以及基因刪除質(zhì)粒pMAD△PVL、pMAD△SpA和pMAD△Coa，并成功獲得金黃色葡萄球菌PVL，SpA

7、和Coa基因缺失突變株P(guān)VL(-)，SPA(-)和Coa(-);2)感染24 h后，經(jīng)轉(zhuǎn)染了PVL，SpA和Coa表達(dá)質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染的MC3T3-E1細(xì)胞增殖抑制率分別為29.2％，42.8％和32.7％，與單純金黃色葡萄球菌感染組別(28.2％)相比均有升高;經(jīng)轉(zhuǎn)染了PVL，SpA和Coa基因刪除質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染的細(xì)胞增殖抑制率分別為12.3％，12.1％和17.2％，與單純金黃色葡萄球菌感染組別相比均有下降。隨著作

8、用時(shí)間越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染毒力因子表達(dá)質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染組別其抑制效果顯著地升高，而轉(zhuǎn)染毒力因子基因刪除質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染組別其抑制效果顯著地減弱;與單純金黃色葡萄球菌感染組相比，含有PVL，SpA和Coa表達(dá)質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率明顯提高;而含有PVL，SpA和Coa基因刪除質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率略有下降;PVL，SpA和Coa表達(dá)質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組細(xì)胞的pro-ca

9、spase-3表達(dá)量比單純金黃色葡萄球菌感染組明顯下降(P＜0.05)，cleaved-caspase-3表達(dá)量顯著升高;而轉(zhuǎn)染PVL，SpA和Coa基因刪除質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組細(xì)胞的pro-caspase-3表達(dá)量比單純金黃色葡萄球菌感染組略有升高(P＜0.05)，cleaved-caspase-3表達(dá)量略有下降，但是兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。pro-caspase-9和cleaved-caspase-9的表達(dá)水平與pro-caspa

10、se-3和cleaved-caspase-9表達(dá)水平趨勢(shì)一致;3）金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SpA和Coa抑制collagenⅠ、OPN和OCN mRNA水平的表達(dá);4）與未感染組相比，含有PVL，SpA和Coa表達(dá)質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組細(xì)胞的鈣沉淀顯著地降低(P＜0.05)，ALP活性也顯著地降低(P＜0.05)。與金黃色葡萄球菌感染組相比，含有PVL，SpA和Coa表達(dá)質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組細(xì)胞的鈣沉淀顯著地降低，ALP活性

11、也明顯地降低（P＜0.05）;5）未感染組細(xì)胞中RANK-L的表達(dá)非常低。與未感染組相比，金黃色葡萄球菌感染組，含有PVL，SpA和Coa表達(dá)質(zhì)?；蚧騽h除質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組MC3T3-E1細(xì)胞的RANK-L表達(dá)顯著地升高，具有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。與培養(yǎng)基感染組相比，金黃色葡萄球菌感染組細(xì)胞的RANK-L表達(dá)明顯地增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1）金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SpA和Coa以時(shí)間依賴方式抑制MC3

12、T3-E1細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞發(fā)生凋亡，PVL，SpA和Coa可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞發(fā)生凋亡;2）金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SpA和Coa抑制collagenⅠ、OPN和OCN mRNA水平的表達(dá)，影響了成骨細(xì)胞的正常代謝;3）金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SpA和Coa抑制成骨細(xì)胞的礦化和ALP的活性，影響成骨細(xì)胞的分化;4）金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SpA和Coa促進(jìn)成骨細(xì)胞中RANK-