2型糖尿病血小板凋亡的臨床及機制研究.pdf

1、近年來，越來越多的研究證實血小板作為一種無核細胞能夠進行程序性死亡?；瘜W激動劑（包括凝血酶、膠原蛋白、ADP等）、氧化應激誘導的病理條件（包括高脂血癥、2型糖尿病及尿毒癥等）及物理性因素（體溫過高、血流剪切力等）等條件均可誘導血小板發(fā)生凋亡。血小板凋亡在血小板依賴的生物學進程、血栓與止血及調(diào)控血小板壽命中扮演著重要的角色。在2型糖尿病患者中，動脈粥樣和微血管病變是常見的并發(fā)癥，包括高糖血癥、血脂異常和脂氧化物、炎癥因素及血小板高反應性在

2、內(nèi)的多種因素被認為參與到動脈粥樣硬化的過程中。已有研究證實在2型糖尿病患者中存在著血小板反應性增加的情況，但是目前有關機制仍不明確。過多的血栓素A2合成、脂過氧化物及血小板活性增加被認為可能與2型糖尿病患者的血小板功能失調(diào)有關。目前有關2型糖尿病患者中血小板凋亡扮演的作用仍不明確。另外，糖尿病高脂血癥是一種常見的糖尿病并發(fā)疾病，其發(fā)病原因是由糖尿病引起的脂質(zhì)代謝出現(xiàn)異常，導致患者血漿內(nèi)脂質(zhì)水平超標。在目前的臨床實踐中，他汀類藥物最常被用

3、于控制血膽固醇，其被作為一線藥物用于治療冠心病及動脈粥樣硬化，2型糖尿病等疾病合并血膽固醇升高時也常規(guī)使用。他汀類藥物能夠通過抑制3-羥基-3甲基戊二酸單酰輔酶A(hydroxymethy glutaryl coenzyme A, HMG-CoA)還原酶將HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥鎢酸，從而減少膽固醇的生成。他汀類藥物被認為能夠產(chǎn)生多種有益的效應，被報道能夠誘導腫瘤細胞的凋亡并用于腫瘤的治療。然而有研究認為，他汀類藥物也能夠產(chǎn)生副作用，血

4、小板減少癥就是其中之一，目前有關他汀類藥物對血小板凋亡的效應仍不明確。在本文中，我們將聚焦于血小板凋亡這一生物學過程，通過分子細胞手段，明確2型糖尿病患者及他汀類藥物導致的血小板凋亡的機制。
　　第一部分 2型糖尿病患者血小板凋亡及其相關機制的研究
　　目的:觀察2型糖尿病患者中血小板凋亡的情況并初步探索其相關的發(fā)生機制。
　　方法:本研究共納入25例確診的2型糖尿病患者及11例年齡匹配的健康對照個體，記錄這些個體的臨

5、床資料、在空腹時采集這些個體的靜脈血并測定這些個體的血糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)的水平。通過離心法從采集的靜脈血中獲得富血小板血漿，分別采用流式細胞術檢測鈣離子載體A23187刺激后血小板磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻及線粒體跨膜電位(Mitochondrialmembrane potential，△ψm)去極化，Western-blot檢測凋

6、亡相關蛋白Caspase-3，Bcl-2及Bcl-XL等凋亡指標。進一步采用不同濃度（50-400μg/ml）的AGEs與健康個體的洗滌血小板進行孵育后，流式細胞術檢測血小板磷脂酰絲氨酸外翻及線粒體跨膜電位去極化，Western-blot檢測凋亡相關蛋白Caspase-3及Bax的表達水平。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示，相比于健康對照組個體，2型糖尿病患者血漿中AGEs的水平有顯著的升高(p＜0.05);血小板的線粒體跨膜電位顯著下降。經(jīng)

7、鈣離子載體A23187刺激后糖尿病患者來源血小板磷脂酰絲氨酸外翻相比于對照組有顯著升高。Pro-caspase-3、Bcl-2及Bcl-XL水平相較于對照組有顯著的下降，active caspase-3的表達則相較對照組有所上調(diào)。當健康的血小板采用不同濃度的AGEs刺激后，能夠出現(xiàn)濃度依賴線粒體跨膜電位下降。高濃度的AGEs能夠顯著誘導血小板磷脂酰絲氨酸外翻，并且經(jīng)免疫印跡檢測顯示經(jīng)AGEs誘導后，洗滌血小板中active caspas

8、e-3及Bax的表達水平升高，并呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢。
　　結(jié)論:研究表明2型糖尿病患者中血小板凋亡的現(xiàn)象相比于正?；颊哂兴黾?，2型糖尿病患者中顯著升高的AGEs可能是導致血小板凋亡增加的重要原因。
　　第二部分 他汀類藥物導致血小板凋亡及其相關機制的研究
　　目的:明確他汀類藥物洛伐他汀對血小板凋亡的誘導效應并探索其相關的機制。
　　方法:通過采集健康人靜脈血，分離獲得洗滌血小板后，采用不同濃度的他汀類藥物洛伐

9、他?。?.25μM-25μM）進行刺激后，流式細胞術檢測血小板線粒體膜電位去極化明確血小板的凋亡。免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白Bak、Bcl-XL及活化的caspase-3/9/8。隨后將經(jīng)不同濃度洛伐他汀刺激后血小板磷脂酰絲氨酸外翻的情況采用流式細胞術進行檢測，通過p選擇素及PAC-1的活化觀察洛伐他汀對血小板活化的影響。在機制探索方面，利用中國倉鼠卵細胞（Chinese hamster ovary，CHO）細胞作為模型，通過采用整合素

10、αⅡbβ3拮抗劑RGDS處理后，流式細胞術檢測CHO細胞線粒體膜電位去極化及細胞凋亡情況。將野生型及穩(wěn)定表達整合素αⅡbβ3的中國倉鼠卵母細胞采用洛伐他汀處理24h后，流式細胞術檢測細胞凋亡。最后通過建立小鼠體內(nèi)實驗模型，采用5 mg/kg的洛伐他汀進行腹腔注射后，采集外周血檢測循環(huán)血小板的數(shù)量。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示，洛伐他汀處理能夠誘導血小板線粒體膜電位去極化，并呈現(xiàn)劑量依賴的效應，經(jīng)免疫印跡檢測顯示Bak水平升高，Bcl-XL

11、水平下降及caspase3/8/9的活化。洛伐他汀處理不能增加血小板表面p選擇素表達增加及PAC-1結(jié)合。經(jīng)整合素αⅡbβ3拮抗劑RGDS處理后，洛伐他汀誘導的血小板凋亡受到抑制;另外在穩(wěn)定表達整合素αⅡbβ3的CHO細胞中洛伐他汀誘導的凋亡現(xiàn)象較野生型顯著增加。腹腔注射洛伐他汀的小鼠循環(huán)血小板的數(shù)量會出現(xiàn)顯著的下降。
　　結(jié)論:研究表明他汀類藥物洛伐他汀能夠通過caspase依賴的途徑誘導血小板凋亡。另外洛伐他汀并不會引起血小板