第一部分ATF6對肝癌細胞系活性影響的研究第二部分HBV對thapsigargin引發(fā)的內質網(wǎng)應激反應影響的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 ATF6對肝癌細胞系活性影響的研究
　　內質網(wǎng)是調控蛋白質進行折疊修飾的重要細胞器，然而，在一些理化因素的作用下，內質網(wǎng)內環(huán)境常常發(fā)生巨大變化，引發(fā)內質網(wǎng)應激，進而發(fā)生未折疊蛋白反應。轉錄活化因子ATF6是未折疊蛋白反應中的主要信號轉導分子之一，其分子大小為90kDa，可促進分子伴侶表達，提高內質網(wǎng)對蛋白質的轉運、折疊能力。近來有研究顯示腫瘤細胞由于其特殊的內外環(huán)境，常常伴隨著

2、未折疊蛋白反應的發(fā)生，且ATF6作為重要的轉導分子與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的聯(lián)系，但其對肝細胞肝癌的作用卻鮮有報道。
　　研究目的:在肝癌細胞系中過表達ATF6基因，鑒定ATF6對肝癌細胞活性、遷移、侵襲及克隆形成能力的影響。
　　研究方法:采用本實驗室已構建的p3 X-Flag-CMV-14-ATF6真核表達質粒，分別對肝癌細胞系HepG2和SMMC7721進行瞬時轉染以上調ATF6基因的表達水平，同時以未經(jīng)處理和轉染

3、p3X-Flag-CMV-14空載質粒的細胞作為空白對照和陰性對照。通過MTT細胞活性實驗、劃痕實驗、Transwell遷移及侵襲實驗和克隆形成實驗等，探究ATF6對肝癌細胞系的影響。
　　研究結果:在HepG2及SMMC7721細胞系中分別瞬時轉染ATF6真核表達質粒后，qPCR檢測，ATF6的mRNA表達水平顯著升高。MTT細胞活性檢測實驗結果顯示，上調ATF6基因表達水平后，兩種細胞系的細胞活性與陰性對照組相比無明顯改變。劃

4、痕實驗中，上調ATF6基因表達水平可使兩種細胞系的遷移距離增加。Transwell遷移實驗中，上調兩種細胞系的ATF6基因表達水平顯著增加了Transwell下室面的細胞數(shù)量。Transwell侵襲實驗中，ATF6的過表達同樣顯著增加了Transwell下室面上兩種細胞的數(shù)量。克隆形成實驗中，提高ATF6基因表達水平可提高兩種細胞系克隆形成集落的數(shù)量。
　　研究結論:在肝癌細胞系HepG2和SMMC7721中，提高ATF6的表達水

5、平，均可顯著增強細胞的遷移、侵襲及克隆形成能力，而對細胞活性無明顯影響。
　　第二部分 HBV對thapsigargin引發(fā)的內質網(wǎng)應激反應影響的研究
　　毒胡蘿卜素是一種潛在的抗腫瘤藥物，它可以通過對內質網(wǎng)中鈣泵的抑制而引發(fā)內質網(wǎng)應激反應，從而有效的引發(fā)細胞凋亡。肝細胞肝癌在世界范圍內屬于第六大癌癥，是造成腫瘤相關死亡的第三大因素。而在中國，乙肝病毒感染是造成肝癌產(chǎn)生的主要原因。
　　研究目的:利用乙肝病毒呈陽性的H

6、epG2.2.15和乙肝病毒呈陰性的HepG2的兩種肝癌細胞系，探究乙肝病毒在毒胡蘿卜素引發(fā)的凋亡中的作用。
　　研究方法:首先在HepG2.2.15和HepG2中細胞分別加入毒胡蘿卜素，顯微鏡觀察0小時、24小時、48小時、72小時和96小時后細胞的形態(tài)學變化。繼而通過MTT細胞活性實驗和流式細胞凋亡實驗確定兩種肝癌細胞系經(jīng)毒胡蘿卜素處理后，在各個時間點細胞的凋亡情況。通過qPCR檢測兩種細胞在經(jīng)過毒胡蘿卜素處理后各個時間點內質

7、網(wǎng)應激反應通路中相關基因的mRNA表達水平，確定了主要作用基因CHOP，并通過Western blotting檢測CHOP蛋白質水平的表達。此外，我們用干擾素IFNα處理HepG2.2.15細胞后檢測乙肝病毒被抑制時細胞凋亡情況及內質網(wǎng)應激通路中主要基因表達量的變化，最后我們分別在HepG2.2.15和HepG2細胞中提高和敲低CHOP基因的表達量，通過MTT實驗檢測兩種細胞系凋亡狀態(tài)發(fā)生的變化。
　　研究結果:毒胡蘿卜素處理后顯

8、微鏡觀察細胞顯示HepG2.2.15比HepG2細胞有著更好的細胞形態(tài)。通過MTT細胞凋亡實驗與流式細胞儀進一步證實在毒胡蘿卜素處理后，乙肝病毒呈陰性的HepG2細胞比乙肝病毒呈陽性的HepG2.2.15細胞有更高的凋亡水平。此外，細胞周期實驗顯示，經(jīng)毒胡蘿卜素處理后，HepG2細胞中G2期細胞所占的比例高于HepG2.2.15細胞。qPCR對內質網(wǎng)應激通路相關基因的檢測分析，確定CHOP為主要變化基因，通過Western blotti