靶向DDX1基因敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建及其對神經(jīng)母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的影響.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 DDX1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)
　　目的:
　　探討神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本中瘤組織及瘤旁組織中DDX1(Dead box1)基因的表達(dá)，驗證DDX1基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，為本課題研究提供理論與實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.神經(jīng)母細(xì)胞瘤DDX1表達(dá):取5例初診兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤的瘤組織及瘤旁組織，固定于4％的甲醛溶液中。將以上樣品石蠟包埋和切片后，采用DDX1抗

2、體行免疫組化實驗，觀察瘤組織及瘤旁組織中DDX1的表達(dá)。
　　2.免疫組化法半定量DDX1評分標(biāo)準(zhǔn):
　　A.染色程度評分:
　　不著色（0分）;淺著色（1分）;著色明顯（2分）;深著色（3分）。
　　B.陽性細(xì)胞比例:
　　陽性細(xì)胞:＜10％（0分）;10％～30％（1分）;31％～60％（2分）;≥61％（3分）。
　　3.最終評分計算:
　?、僭u分計算公式:(A+B)/2。
　?、诎?/p>

3、定量換算:評分0～1分計為“-”;1.1～2.0分計為“+”;2.1～3.0分計為“++”;3.1～5.0計為“+++”。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)免疫組化檢測5例標(biāo)本，每例的檢測結(jié)果均顯示，腫瘤組織的DDX1表達(dá)染色評分和陽性細(xì)胞百分率均明顯高于瘤旁組織。瘤組織中DDX1表達(dá)最終評分均值為1.8分，均為陽性;而瘤旁組織DDX1表達(dá)評分均值為0.5分，定量換算均為“-”，提示神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織的DDX1表達(dá)明顯高于瘤旁非腫瘤組織。<

4、br>　　結(jié)論:
　　結(jié)果顯示，神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤組織確實存在DDX1高表達(dá)，為本課題開展DDX1基因與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的相關(guān)性研究，提供充分的理論與實驗依據(jù)。
　　第二部分 靶向DDX1基因敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建
　　目的:
　　建立DDX1基因敲減的SK-N-BE(2)細(xì)胞系，為后續(xù)開展DDX1基因表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為相關(guān)性研究，提供有效實驗條件。
　　方法:
　　1.設(shè)計sh靶點，構(gòu)建pLenti

5、6.3-EGFP-shDDX1干擾慢病毒載體，并使用293T細(xì)胞包裝慢病毒。
　　2.將包裝好的病毒感染SK-N-BE(2)細(xì)胞，感染成功的細(xì)胞會穩(wěn)定表達(dá)GFP綠色熒光。
　　3.使用qPCR及Western blot技術(shù)檢測各個靶點的敲減效率，并選擇效率最高的靶點進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)qPCR及Western blot實驗均顯示，2號靶點的敲減效率最高(＞60％)，成功建立DDX1敲減的SK-N-B

6、E(2)細(xì)胞系。
　　結(jié)論:
　　使用慢病毒感染的方法，可以成功得到DDX1敲減的SK-N-BE(2)穩(wěn)定細(xì)胞株。為本課題開展DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為影響相關(guān)研究，提供有效實驗條件。
　　第三部分 DDX1對SK-N-BE(2)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響
　　目的:
　　觀察SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/shV和SK-N-BE(2)/shDDX1的細(xì)胞周期、增殖能

7、力和細(xì)胞凋亡等方面的差異，揭示DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞活力影響。
　　方法:
　　1.CCK-8法觀察細(xì)胞增殖能力:將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/shV和SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種數(shù)目為2000個細(xì)胞，并設(shè)5個副孔。使用CCK-8試劑盒分別檢測12h、24h、36h、48h3組細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，并取平均值，以時間(h)為橫坐標(biāo)，45

8、0 nm處的OD讀數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制3種細(xì)胞的增殖曲線，觀察DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力的影響。
　　2.流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡:將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/shV和SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種數(shù)目為3×105個細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后使用流式細(xì)胞儀PI染色檢測SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/shV和SK-N-B

9、E(2)/shDDX1細(xì)胞的凋亡差異，觀察DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期:將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/shV和SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種數(shù)目為3×105個細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后使用流式細(xì)胞儀PI染色檢測SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE/shV和SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞各

10、自位于G1、S、M、G2期的細(xì)胞比例，觀察DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果:
　　1.SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞增殖能力明顯弱于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/shV細(xì)胞，提示DDX1敲減后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力減弱。
　　2.SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯多于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/shV細(xì)胞，提示DDX1敲減后

11、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡增加。
　　3.相對于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/shV細(xì)胞，SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞增殖能力下降。
　　結(jié)論:
　　抑制DDX1表達(dá)，可導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞周期受阻，增殖能力減弱，細(xì)胞凋亡增加。提示，DDX1表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　第四部分 DDX1對SK-N-BE(2)細(xì)胞侵襲、遷移及耐藥能力的影響

12、>　　目的:
　　探討DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲、遷移及耐藥能力的影響。
　　方法:
　　1.目的病毒及陰性對照慢病毒感染目的細(xì)胞:將細(xì)胞懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（3×105個細(xì)胞/孔），5％ CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
　　2.Transwell檢測細(xì)胞遷移:用胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108個/L;加入0.1 mL細(xì)胞懸液于小室中，同時在下層孔板中加0.6 mL完全培養(yǎng)基;用鑷子將小

13、室放到加有培養(yǎng)基的孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);每天觀察遷移情況，48 h時停止培養(yǎng);取出小室，去除小室中的上清，用棉簽擦掉小室上層的細(xì)胞;吸取0.5 mL4％多聚甲醛置于另一個干凈的孔中，放入小室，室溫固定15 min。
　　3.結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞遷移率:吸取1 mL洗滌液(Regent A)置于另一孔中，潤洗小室。吸取1 mL染色液(Regent B)置于另一個孔中，放入小室進(jìn)行染色，室溫放置20min。取1mL Regent A

14、置于步驟1的洗滌孔中，將小室放回洗滌孔中洗滌，直到Regent A無色時，顯微鏡下拍照。每個小室選取5個視野計數(shù)，計算細(xì)胞的侵襲率。在干凈的孔中加入600μL的裂解液(Regent C)，放入小室，37℃孵育20min，直至呈藍(lán)紫色澄清溶液，去掉小室，吸取100μL孔板中的溶液至于另一個清潔的孔板中。酶標(biāo)儀檢測570nm處的OD值，計算細(xì)胞遷移率。
　　結(jié)果:
　　1.SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞侵襲能力明顯弱于S

15、K-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/shV細(xì)胞。提示敲減DDX1，能使神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞侵襲能力下降。
　　2.SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞遷移能力明顯弱于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/shV細(xì)胞。提示敲減DDX1，能使神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞遷移能力減弱。
　　3.使用阿霉素和順鉑處理后，SK-N-BE(2)/shDDX1的活細(xì)胞數(shù)明顯低于SK-N-BE(2)/Blank和S

16、K-N-BE(2)/shV細(xì)胞。提示敲減DDX1，能夠提高神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對阿霉素和順鉑等化療藥物的敏感性。
　　結(jié)論:
　　抑制DDX1表達(dá)，可降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞侵襲和遷移能力，并提高對于阿霉素和順鉑等惡性實體腫瘤主要化療藥物的敏感性。
　　全文歸納:
　　1.課題研究依據(jù):兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤的年發(fā)病率僅為0.3/10萬～0.5/10萬，但本課題仍在研究前期積累到5例初診兒童病例，檢測驗證神經(jīng)母細(xì)胞瘤確實存在

17、DDX1高表達(dá)，使本研究獲得盡可能充分的理論與實驗依據(jù)。
　　2.實驗條件制備:成功建立DDX1基因敲減的SK-N-BE(2)細(xì)胞系，為本課題開展DDX1基因?qū)ι窠?jīng)母細(xì)胞瘤功能的影響研究，提供有效實驗條件。
　　3.研究結(jié)果歸納:通過細(xì)胞株對比研究發(fā)現(xiàn)，敲減DDX1，能使神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖受阻、增殖能力下降、腫瘤細(xì)胞的侵襲或遷移能力減弱，并可導(dǎo)致對阿霉素和順鉑等化療藥物的敏感性增加。均提示DDX1基因表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞