Astrocyte elevated gene-1對(duì)腎母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　腎母細(xì)胞瘤，又稱Wilms瘤，約占所有兒童腫瘤的比例為8％，是兒童比較常見(jiàn)的惡性腫瘤，同時(shí)也是兒童泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤。近些年來(lái)，雖然經(jīng)過(guò)手術(shù)、化療、放療等綜合治療，腎母細(xì)胞瘤的生存率有所提高，但仍有部分患兒由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療藥物的不敏感導(dǎo)致治療效果不佳而死亡。因此，探討腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找腎母細(xì)胞瘤的分子生物學(xué)標(biāo)記物，具有重要的意義。
　　Astrocyte elevated g

2、ene-1(AEG-1)是Su等在2002年首次克隆出來(lái)的新基因，最早發(fā)現(xiàn)于感染HIV病毒的PHFA(primary human fetal astrocytes)細(xì)胞。近年來(lái)對(duì)AEG-1的深入研究，發(fā)現(xiàn)AEG-1能激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如PI3K/AKT、NF-κB、MEK/ERK、WNT/β-catenin等，與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、抗凋亡、耐藥等密切相關(guān)。盡管在多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞如胃癌、食管癌、肝細(xì)胞肝癌、惡性神經(jīng)

3、膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌及前列腺癌等以及多種腫瘤組織標(biāo)本中都發(fā)現(xiàn)AEG-1表達(dá)顯著升高并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了研究，但是，AEG-1與腎母細(xì)胞瘤中的相關(guān)性研究，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。
　　RNA干擾（RNA interfering，RNAi）技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于基因功能、基因表達(dá)調(diào)控、基因治療以及調(diào)控細(xì)胞行為等多個(gè)領(lǐng)域，成為重要的研究工具。由慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)載體因其表達(dá)持久、安全性好等自身優(yōu)勢(shì)，在基因治療的

4、研究中得到了廣泛的應(yīng)用，并成為目前RNAi研究和轉(zhuǎn)基因的最佳工具之一。
　　基于以上研究背景，本課題研究AEG-1在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，及其與臨床特征的關(guān)系及對(duì)病人預(yù)后的影響;構(gòu)建靶向AEG-1特異性RNA干擾慢病毒表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)染人高表達(dá)AEG-1的G401細(xì)胞株，沉默其AEG-1基因的表達(dá)，研究AEG-1基因被抑制后G401細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲、周期、調(diào)亡、化療敏感性等方面的影響并檢測(cè)與之相關(guān)的蛋白水平，初步探討其可能的

5、分子機(jī)制，為臨床尋找腎母細(xì)胞瘤基因治療的新靶點(diǎn)提供借鑒。
　　方法：
　　1.AEG-1在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響:選取山東省立醫(yī)院腎母細(xì)胞瘤手術(shù)切除標(biāo)本42例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)AEG-1的表達(dá)，并分析其與臨床特征的關(guān)系及對(duì)病人預(yù)后的影響。
　　2.慢病毒介導(dǎo)的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞AEG-1基因沉默:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR)及蛋白質(zhì)印跡(western blot)技術(shù)檢測(cè)人胚腎細(xì)

6、胞株CCC-HEK-1和人腎Wilms瘤細(xì)胞株G401中AEG-1的表達(dá)情況。構(gòu)建針對(duì)AEG-1基因的、帶綠色熒光蛋白標(biāo)記的、由U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的慢病毒RNAi載體，轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)并確定轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、western blot分別檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后AEG-1mRNA和蛋白的水平變化情況，分析并確定RNA干擾的抑制效率，最終篩選出AEG-1沉默效率較高的干擾片段。
　　3.AEG-1基

7、因沉默對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制研究:將篩選出的最佳沉默效果的慢病毒載體轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞，沉默AEG-1的基因表達(dá)，通過(guò)MTT法檢測(cè)AEG-1干擾后G401細(xì)胞增殖能力的變化;通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AEG-1沉默后G401細(xì)胞遷移能力變化，通過(guò)transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AEG-1基因干擾后G401細(xì)胞的侵襲能力的變化，采用western blot檢測(cè)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的

8、變化;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)AEG-1沉默對(duì)G401細(xì)胞周期和凋亡的影響，采用western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK2、p21Cip1、p27Kip1以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)變化;MTT法檢測(cè)AEG-1沉默后G401細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素和放線菌素D的敏感性變化情況，采用western blot檢測(cè)耐藥基因MDR1蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.AEG-

9、1在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響:在納入研究的42例腎母細(xì)胞瘤中，腫瘤組織中AEG-1高表達(dá)21例(50％)，而瘤周正常組織中檢測(cè)不到AEG-1表達(dá)。AEG-1的表達(dá)情況在不同臨床分期(P=0.019)、病理分型(P=0.048)、復(fù)發(fā)情況(P=0.015)的患兒之間有顯著性差異，而在不同性別(P=0.751)、年齡(P=0.354)的患兒之間無(wú)顯著性差異。AEG-1高表達(dá)組的5年DFS和OS均顯著低于低表達(dá)組(P=0.006和P

10、=0.007)。
　　2.慢病毒介導(dǎo)的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞AEG-1基因沉默:real time PCR和western blot檢測(cè)證實(shí)G401細(xì)胞中AEG-1mRNA和蛋白水平顯著高于CCC-HEK-1細(xì)胞。以AEG-1mRNA基因序列為靶目標(biāo)進(jìn)行干擾片段設(shè)計(jì)，成功構(gòu)建了2對(duì)針對(duì)AEG-1基因不同位點(diǎn)的特異性RNA干擾序列，經(jīng)化學(xué)修飾后與pGCSIL-GFP慢病毒載體連接，通過(guò)轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，鑒定干擾片斷的插入位點(diǎn)和堿基

11、序列與設(shè)計(jì)相符;在293T細(xì)胞中包裝慢病毒，獲得高滴度慢病毒上清;利用慢病毒將AEG-1基因的RNA干擾片段轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞，并測(cè)定轉(zhuǎn)染效率達(dá)80％以上，real time PCR和western blot檢測(cè)證實(shí)與未轉(zhuǎn)染組相比，干擾組(AEG-1RNAi-LV1和AEG-1RNAi-LV2)的AEG-1mRNA和蛋白水平顯著降低，其中又以AEG-1RNAi-LV1的下降更明顯，說(shuō)明在2個(gè)干擾靶點(diǎn)中，AEG-1RNAi-LV1的干擾效果

12、做好，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用該組。
　　3.AEG-1基因?qū)δI母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)、遷移、細(xì)胞周期及耐藥性具有明顯的調(diào)節(jié)作用:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示與未轉(zhuǎn)染組相比，AEG-1干擾后細(xì)胞增殖能力不斷下降，至第5天(120h)有顯著性差異(P＜0.0001);在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的劃痕區(qū)域增寬，且在觀察48h時(shí)有顯著性差異(P=0.0413)，該結(jié)果表明下調(diào)AEG-1抑制了細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，且有顯著性差異(P=0.0238);細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的下降與MMP2和MMP

13、9蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)，MMP2與MMP9的表達(dá)明顯下調(diào)，差異顯著(P=0.0395，P=0.0213);AEG-1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的能力，結(jié)果顯示S期細(xì)胞比例明顯減少，而G0/G1期細(xì)胞比例明顯增多(P＜0.001)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白p21Cip1和p27Kip1表達(dá)顯著增加(P＜0.001);AEG-1的下調(diào)亦能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞調(diào)亡比例增多(P=0.0024)，而調(diào)控細(xì)胞凋亡的核心蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)

14、水平顯著降低(P=0.024)，Bax和Caspase-3蛋白顯著增加(P＜0.001);AEG-1也能影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥性的變化，結(jié)果表明AEG-1的低表達(dá)對(duì)阿霉素和放線菌素D的半數(shù)抑制濃度IC50均顯著降低(P＜0.001)，MDR1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P=0.0018)。
　　結(jié)論：
　　1.AEG-1的表達(dá)情況在不同臨床分期、病理分型、復(fù)發(fā)情況的患兒之間有顯著性差異，AEG-1高表達(dá)提示預(yù)后不良。
　

15、　2.G401細(xì)胞的AEG-1mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組細(xì)胞。成功構(gòu)建2種慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)AEG-1RNAi載體，可穩(wěn)定表達(dá)于靶細(xì)胞G401，能下調(diào)其目的基因AEG-1的mRNA和蛋白表達(dá)，尤其以AEG-1-RNAi-LV1沉默效果更好。
　　3.沉默AEG-1基因后，G401細(xì)胞的增殖能力下降;通過(guò)降低MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平，使G401細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力下降;通過(guò)增加p21Cip1和p27Kip1蛋白表達(dá)