厚樸酚對戊四氮點燃慢性癲癇大鼠行為及海馬BDNF表達的影響.pdf

1、目的:癲癇是神經系統(tǒng)中一種常見的慢性疾病，影響著約全世界大約有1％-2％人口，具有較高的發(fā)生率和死亡率。其臨床特征為短暫性、發(fā)作性、重復性、刻板性。電生理特征為腦內神經元高度同步化異常放電。以神經元凋亡，尤其是海馬等邊緣系統(tǒng)的神經元凋亡伴膠質細胞增生為主要病理改變。目前，有效藥物治療僅能控制住70％的癲癇發(fā)作，仍有30％癲癇患者發(fā)展成難治性癲癇，約30-40％的患者伴有認知功能障礙，表現(xiàn)為記憶力減退、語言障礙、執(zhí)行力差、社會認知障礙等方

2、面。因此，癲癇仍然是困擾人類的一大難題，尋求一種既能控制癲癇發(fā)作又能改善認知功能的藥物迫在眉睫。
　　本實驗的研究對象為戊四氮點燃的慢性癲癇大鼠模型，分別用厚樸酚(magnolol，Mag)高、中、低三個劑量對其進行干預，統(tǒng)計點燃率來反應癲癇發(fā)作情況，通過Morris水迷宮檢測致癇大鼠認知功能，應用WesternBlot及免疫組化方法檢測BDNF(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)在海

3、馬組織中的表達情況，以觀察厚樸酚對戊四氮點燃癲癇大鼠的行為、認知及海馬BDNF表達的影響，并初步探討厚樸酚對戊四氮(Pentylenetetrazole，PTZ)致癇大鼠的神經保護機制。
　　方法:選用健康清潔的雄性SD大鼠75只，體重約為250-300g。采用隨機對照分組原則，分為正常對照組(NC組)、戊四氮組（PTZ組）、低劑量厚樸酚組（L組）、中劑量厚樸酚組（M組）、和高劑量厚樸酚組（H組），每組大鼠15只。自實驗第一天起，

4、每天上午10點除NC組外各組大鼠腹腔注射PTZ35mg/kg，NC組大鼠注射相同計量的生理鹽水，共計42天。L組、M組和H組于注射PTZ前半小時分別通過腹腔注射低劑量(2.5mg/kg)厚樸酚、中劑量(5mg/kg)厚樸酚、高劑量(10mg/kg)厚樸酚。打藥后分別觀察大鼠癲癇發(fā)作情況1小時，依據(jù)Racine分級來評價大鼠癲癇發(fā)作等級。于藥物注射結束24小時后，進行Morris水迷宮測試評價學習記憶能力，從而評估認知受損情況。水迷宮實驗

5、結束后斷頭取腦分離海馬組織，用Western Blot方法檢測BDNF蛋白表達水平;對相關腦組織固定，用透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結構變化或者免疫組織化學方法觀察BDNF在海馬中的表達情況。
　　結果:
　　1行為學觀察 PTZ組大鼠從第4-6天開始反復出現(xiàn)洗臉、點頭及面部抽搐等表現(xiàn)，第7-15天出現(xiàn)單側前肢或雙前肢抬起、全身肌陣攣，最終出現(xiàn)全身強直陣攣性發(fā)作，達到Racine分級完全點燃的標準。截止到第42天，點燃大鼠毛

6、發(fā)無光澤，精神萎靡，飲食尚可，體重未出現(xiàn)明顯變化。PTZ組大鼠點燃率為93.3％，明顯高于L組、M組、H組和NC組(P＜0.05)。與PTZ組大鼠相比，厚樸酚給藥組大鼠點燃時間延長，發(fā)作等級明顯降低，第8-10天大鼠開始出現(xiàn)洗臉、點頭及面部抽搐等表現(xiàn)。截止到第42天，厚樸酚給藥組大鼠中L組、M組、H組大鼠點燃率分別為6.7％、13.3％、33.3％，三組間兩兩比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2水迷宮測試結果定位航行實驗結

7、果:①以各組大鼠每日逃避潛伏期均值進行比較。(1)實驗第1天，PTZ組大鼠的逃避潛伏期（71.635±6.905）與NC組大鼠（42.206±8.316）相比有所延長，與PTZ組相比，H組（60.158±6.302）、M組（57.426±5.912）和L組（59.346±7.213）的逃避潛伏期均有所縮短，但各組間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2)第2天，各組大鼠逃避潛伏期均比第1天明顯縮短(P＜0.05)，PTZ組的逃避潛伏期（

8、28.563±4.372）與NC組（8.452±2.121）相比明顯延長(P＜0.05);與PTZ組相比，H組（21.260±5.165）、M組（17.123±5.272）和L組（20.145±4.265）的逃避潛伏期均有所縮短(P＜0.05)，且與NC組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(3)第3天，各組大鼠逃避潛伏期均較第2天明顯縮短(P＜0.05)，NC組（6.258±2.192）、PTZ組（23.456±4.265）、H組（15

9、.321±4.132）、M組（12.365±3.234）、L組（14.259±3.124）的逃避潛伏期相互比較結果同第2天。(4)各組大鼠逃避潛伏期均較第3天又明顯縮短(P＜0.05)，NC組（4.625±1.151）、PTZ組（16.235±2.532）、H組（8.632±2.171）、M組（7.235±1.185）、L組（9.125±1.905）的逃避潛伏期相互比較結果與第3天相同。提示PTZ致癇大鼠學習記憶能力下降，厚樸酚可以部分

10、改善其學習記憶能力。②空間探索試驗結果:PTZ組大鼠（2.78±1.05）與NC組大鼠（19.73±3.21）相比，穿越平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.05);與PTZ組相比，H組（8.63±2.73）、M組（12.71±2.74）、L組（10.89±3.41）穿越平臺次數(shù)明顯增多(P＜0.05)，與NC組相比亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示慢性癲癇大鼠的空間記憶能力下降，而厚樸酚可以改善其空間記憶能力。
　　3透射電鏡觀察海馬CA

11、1區(qū)超微結構變化 NC組電鏡觀察:神經元形態(tài)結構完整，細胞核呈圓形，染色質分布均勻，細胞器豐富，可見圓形或橢圓型線粒體，線粒體嵴清晰，粗面內質網(wǎng)及高爾基體發(fā)達，突觸前后膜結構清晰，靠近突觸前膜可見許多突觸囊泡，突觸間隙清晰。PTZ組電鏡觀察:海馬神經元內質網(wǎng)擴張明顯，線粒體腫脹，嵴變少，細胞核染色質固縮，突觸數(shù)量減少，突觸前后膜模糊不清，突觸間隙增寬，突觸囊泡數(shù)量減少。L組及M組海馬神經元細胞核結構完整，無固縮現(xiàn)象，細胞器的形態(tài)基本正常

12、，突觸數(shù)量基本不減少，突觸前后膜較清楚，突觸前膜的囊泡數(shù)量較多。H組海馬神經元可見線粒體腫脹，嵴變少，內質網(wǎng)擴張，突觸囊泡數(shù)量較少，間隙增寬。
　　4 BDNF免疫組化結果 NC組、PTZ組、L組、M組及H組大鼠海馬組織中均可見到彌漫分布的BDNF免疫反應產物，陽性細胞主要表達在細胞漿中，為染色較深的棕褐色顆粒。NC組海馬CA1及CA3區(qū)400倍視野陽性細胞數(shù)分別為（85.672±6.566，87.369±6.354）;PTZ組海

13、馬CA1區(qū)及CA3區(qū)400倍視野陽性細胞數(shù)分別為（37.743±7.393，35.521±5.231）;H組海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)400倍視野陽性細胞數(shù)分別為(34.245±5.051，34.965±5.967);M組海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)400倍視野陽性細胞數(shù)分別為（69.662±6.093，68.348±6.147）;L組海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)400倍視野陽性細胞數(shù)分別為（55.863±8.125，57.625±7.159）。與L、

14、M組及N組相比，PTZ組海馬CA1及CA3區(qū)400倍視野陽性細胞數(shù)明顯降低（P＜0.05）;與H組相比，PTZ組海馬CA1及CA3區(qū)400倍視野陽性細胞數(shù)升高，但是無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與N組相比，L組、M組、H組海馬CA1及CA3區(qū)400倍視野陽性細胞數(shù)顯著下降(P＜0.05)，N組與L組、M組、H組之間兩兩比較亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5 BDNF Western blot結果與L組（1.148±0.112

15、）、M組（1.972±0.158）及N組（2.317±0.163）相比，PTZ組海馬BDNF蛋白表達水平（1.215±0.167）明顯降低(P＜0.05);與H組（1.148±0.112）相比，PTZ組海馬BDNF蛋白表達水平升高，但是無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與N組相比，L組、M組、H組海馬BDNF蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），N組與L組、M組、H組之間比較海馬BDNF蛋白表達水平有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　

16、結論:
　　1本實驗采用戊四氮化學點燃方法成功建立了伴有認知功能損害的慢性癲癇大鼠模型。
　　2癲癇發(fā)作可以導致透射電鏡下大鼠海馬組織超微結構的改變。
　　3癲癇發(fā)作可導致大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達下降。
　　4厚樸酚能夠降低大鼠癲癇發(fā)作率并且改善致癇大鼠認知功能。進而推測其可能機制為通過上調大鼠海馬組織中BDNF水平從而起到神經保護作用。
　　5本實驗中，5mg/kg厚樸酚劑量可能為改善認知功能且降低