托吡酯對戊四氮點燃大鼠行為、EEG和海馬可塑性變化影響的研究.pdf

1、目的：目前為止，癲癇的發(fā)病機制和病因?qū)W還不是特別清楚，已在許多顳葉癲癇模型和顳葉癲癇病人的海馬上發(fā)現(xiàn)諸如進行性神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細胞增生和突觸重建等神經(jīng)可塑性改變。癲癇形成中的神經(jīng)可塑性研究已經(jīng)成為當前癲癇研究的熱點。點燃是研究癲癇形成和神經(jīng)可塑性的一個理想模型。托吡酯是一種新型抗癲癇藥，通過多重作用機制發(fā)揮抗癲癇作用。本研究通過戊四氮點燃大鼠模型，觀察戊四氮點燃過程中大鼠行為、腦電活動變化以及突觸重建標記物生長相關(guān)蛋白43、膠質(zhì)細胞增生

2、標志物膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白和細胞因子白介素-6在海馬表達的變化及托吡酯對其變化的影響，探討神經(jīng)可塑性在癲癇發(fā)病中的作用，從而為新的治療思路提供理論依據(jù)。 方法：1.健康成年雄性SD大鼠80只，隨機分為4組，每組20只。Ⅰ組大鼠胃管內(nèi)注入生理鹽水(10ml/kg)后1小時腹腔注射10g/L戊四氮(35mg/kg)；Ⅱ組和Ⅲ組大鼠腹腔注射戊四氮(劑量同Ⅰ組大鼠)前1小時分別按100mg/kg和40mg/kg胃灌注10g/L托吡酯生理

3、鹽水溶液；Ⅳ組大鼠按10ml/kg和3.5ml/kg分別胃灌注和腹腔注射生理鹽水，間隔1小時。均每日一次。注射完畢后觀察1小時，記錄癇性發(fā)作的潛伏期及癇性發(fā)作級別。各組選取2個研究時間點，又相應(yīng)分為兩個亞組，分別為Ⅰ組大鼠行為達到Ⅲ級和Ⅴ級時，每個時間點各組大鼠為10只。 2.在每個時間點，各組大鼠做腦電圖描記。除對照組外，余三組均在描記中腹腔注射相同劑量戊四氮，用藥前描記腦電圖10分鐘，用藥后至少連續(xù)描記30分鐘。 對

4、所有大鼠的腦電圖進行定量分析。描記后將大鼠處死。 3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測不同時間點各組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)和CA1區(qū)內(nèi)生長相關(guān)蛋白43、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和細胞因子白介素-6的表達。相關(guān)結(jié)果經(jīng)圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。 4.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)，半定量檢測不同時間點各組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)內(nèi)生長相關(guān)蛋白43、膠質(zhì)纖維酸性蛋白mRNA的表達。 結(jié)果：1.Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠腹腔注射戊四氮后，

5、Ⅰ組大鼠在連續(xù)腹腔注射10天后陸續(xù)出現(xiàn)1-2級發(fā)作，約2周達到Ⅲ級。Ⅱ組和Ⅲ組大鼠于用藥后兩周出現(xiàn)1-2級發(fā)作，4周時，Ⅰ組所有動物達到點燃狀態(tài)，而Ⅱ組和Ⅲ組大鼠最高發(fā)作級別為3級。對照組大鼠行為正常，無癇性發(fā)作。 2.腦電圖描記時間為2周和4周。對照組的腦電記錄顯示正常。2周及4周時，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠腦電記錄可見癲癇波發(fā)放，Ⅰ組大鼠腦電記錄到的癲癇波多于Ⅱ組和Ⅲ組大鼠。與Ⅰ組大鼠相比，Ⅱ組和Ⅲ組大鼠發(fā)作的潛伏期延長，持續(xù)時

6、間縮短(均p＜0.05)。2周時Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠注射PTZ后總功率、δ、θ和α功率均增加(p＜0.05或p＜0.01)，β功率無顯著性改變(P＞0.05)。4周時，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠除Ⅰ組大鼠β功率無顯著性改變外(P＞0.05)，注射PTZ后總功率和其他各頻段功率均增加(p＜0.05或p＜0.01)。 3.在同一個時間點，與對照組相比，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠CA3區(qū)苔狀纖維層，齒狀回的內(nèi)分子層及上顆粒層生長相關(guān)蛋白43免疫反

7、應(yīng)著色增強，圖像分析結(jié)果顯示，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠CA3區(qū)苔狀纖維層，齒狀回的內(nèi)分子層及上顆粒層免疫反生長相關(guān)蛋白43映光密度值比對照組均有統(tǒng)計學(xué)意義的增高(p＜0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅲ組大鼠GAP-43免疫反應(yīng)光密度值有統(tǒng)計學(xué)意義的降低(p＜0.05)，Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間無差異(P＞0.05)。與兩周時相比，四周時Ⅰ組，Ⅱ組和Ⅲ組大鼠CA3區(qū)苔狀纖維層，齒狀回的內(nèi)分子層及上顆粒層生長相關(guān)蛋白43免疫反應(yīng)著色進一步變強，與兩周時

8、相比生長相關(guān)蛋白43免疫反應(yīng)光密度值有統(tǒng)計學(xué)意義的增高(p＜0.05)。 4.在同一個時間點，與對照組相比，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回及海馬CA各區(qū)膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白免疫陽性反應(yīng)增強，以齒狀回的門區(qū)及CA1腔隙-分子層更顯著，可見膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白免疫陽性反應(yīng)細胞增多，膠質(zhì)細胞胞體肥大不明顯，突起增多，免疫陽性細胞計數(shù)有顯著性差異(p＜0.05)。Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白免疫陽性反應(yīng)細

9、胞數(shù)較Ⅰ組減少，有顯著性差異(p＜0.05)，而Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間無顯著性差異(p＞0.05)。與兩周時相比，四周時Ⅰ組Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、CA1區(qū)及CA3區(qū)膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白免疫陽性反應(yīng)進一步增強，免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)進一步增多，與兩周時有顯著性差異(p＜0.05)。 5.2周時，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)內(nèi)白介素6免疫反應(yīng)均比對照組增強(均p＜0.05)，表現(xiàn)為陽性反應(yīng)細胞數(shù)目增多，著色明顯加深，三

10、組之間光密度值無顯著性差異(P＞0.05)。4周時，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)內(nèi)白介素6免疫反應(yīng)進一步增強(p＜0.05)，Ⅰ組比Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)內(nèi)白介素6免疫反應(yīng)更明顯，差異有顯著性(均p＜0.05)，而Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間光密度值無顯著性差異(P＞0.05)。 6.生長相關(guān)蛋白43mRNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)溴乙啶顯色后清晰地顯示出256bp和385bp兩個預(yù)期的條帶，Ⅳ

11、組大鼠之間齒狀回、CA1區(qū)及CA3區(qū)的生長相關(guān)蛋白43mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。在同一時間點，Ⅰ組，Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回及CA3區(qū)的生長相關(guān)蛋白43mRNA表達強于對照組(p＜0.05)，各組在海馬CA1區(qū)生長相關(guān)蛋白43mRNA表達無差異；Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回和CA3區(qū)的生長相關(guān)蛋白43mRNA表達水平較Ⅰ組有統(tǒng)計學(xué)意義的降低(p＜0.05)，而Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間齒狀回和CA3區(qū)的生長相關(guān)蛋白43mRNA表達水平無

12、統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。與2周時相比，四周時Ⅰ組大鼠，Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回和CA3區(qū)的生長相關(guān)蛋白43mRNA表達水平進一步增強(p＜0.05)。 7.膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)溴乙啶顯色后清晰地顯示出256bp和385bp兩個預(yù)期的條帶，Ⅳ組大鼠之間齒狀回，CA1區(qū)及CA3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。在同一時間點，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回，CA1區(qū)及CA

13、3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達強于對照組(p＜0.05)，與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回，CA1區(qū)及CA3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達水平有顯著的下降(p＜0.05)。而在不同時間點，Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間齒狀回，CA1區(qū)及CA3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達水平無差異(p＞0.05)。與2周時相比，Ⅰ組大鼠、Ⅱ組和Ⅲ組齒狀回，CA1區(qū)及CA3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達水平進一步增強(p＜0.05).

14、 結(jié)論：1.戊四氮點燃大鼠海馬生長相關(guān)蛋白43、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白和白介素-6的表達增強，表明反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增生、突觸重建和免疫系統(tǒng)激活參與了癲癇發(fā)生的病理過程。 2.托吡酯對戊四氮點燃的大鼠癲癇發(fā)作行為有抑制作用，兩種劑量的抑制作用無差異。 3.腦電圖定量分析顯示托吡酯可抑制戊四氮點燃的大鼠大腦神經(jīng)元癲癇樣放電。 4.托吡酯可抑制戊四氮點燃大鼠海馬生長相關(guān)蛋白43、膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白和白介素-6的過表達，兩