小鼠肝細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)磷蛋白的動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法初步鑒定小鼠肝細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的磷蛋白組成成分或效應(yīng)蛋白/酶，對(duì)這些磷蛋白在持續(xù)高濃度的EGF(10ng/μl，生理濃度為10-3～10-1ng/μl)刺激不同時(shí)間點(diǎn)的磷酸化水平進(jìn)行半定量分析(獲得相對(duì)反應(yīng)速度數(shù)據(jù))，在細(xì)胞整體表達(dá)的水平上動(dòng)態(tài)的觀察分析細(xì)胞內(nèi)激酶、信號(hào)蛋白等在EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)生的動(dòng)力學(xué)變化，以探討EGF對(duì)小鼠

2、肝細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)改變特點(diǎn)，并進(jìn)一步分析EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中信號(hào)蛋白、信號(hào)途徑之間的相互交流、相互影響、相互作用和相互制約的關(guān)系及其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終生理效應(yīng)的影響。 方法：本實(shí)驗(yàn)采用肝組織塊培養(yǎng)法，原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料；32P同位素標(biāo)記對(duì)照組與刺激組小鼠肝細(xì)胞磷蛋白；給予刺激組高濃度EGF(10ng/μl)分別作用0min、5min、20min、60min、120min等不同時(shí)間后，液氮終止反應(yīng)；裂解細(xì)胞，收集蛋白，

3、Bio-Rad DC法定量蛋白；根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量的不同，采用雙向凝膠電泳(一向采用pH3～10的固相pH梯度等電聚焦電泳，二向采用10％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離蛋白；電泳結(jié)束后，固定凝膠塊并進(jìn)行干膠處理，將干膠片與X光膠片一起放入攝影暗匣，在-70℃冰箱中曝光7日：于自動(dòng)洗片機(jī)內(nèi)沖洗X光膠片，獲得不同時(shí)間點(diǎn)的雙向凝膠電泳放射自顯影圖譜。采用PDQuest 2D分析軟件分析電泳圖譜中磷蛋白的等電點(diǎn)及分子量，將各磷蛋白點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)

4、數(shù)據(jù)與Swiss-Prot/TrEMBL蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)、磷蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(PPDB)及自建磷蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分子量、等電點(diǎn)及磷酸化狀態(tài)的相互比較，初步確定小鼠肝細(xì)胞EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的組成成分或效應(yīng)蛋白/酶等相關(guān)磷蛋白。運(yùn)用PDQaaest 2D分析軟件分析相關(guān)磷蛋白在EGF刺激不同時(shí)間點(diǎn)的磷酸化水平的變化情況，繪制出相應(yīng)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線。 結(jié)果：①雙向凝膠電泳放射自顯影圖譜顯示，對(duì)照組與刺激組磷酸化蛋白點(diǎn)數(shù)目基本相同，大約有100個(gè)蛋

5、白點(diǎn)，分子量在20～120 kDa，豐度較高的蛋白點(diǎn)主要集中在pH4～7的范圍內(nèi)。②經(jīng)PDQuest 2D分析，并結(jié)合Swiss-Prot/TrEMBL及PPDB等數(shù)據(jù)庫(kù)資源初步檢測(cè)到參與EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)且豐度較高的相關(guān)磷蛋白有8種，分別是EGFR底物15(Eps15)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子(STAT1)、熱休克蛋白86(HSP86)、蛋白激酶Ca(PKCa)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2(ERK2)、MAPK磷酸酶3(MKP3)、14-3-3蛋白α/β(

6、14-3-30α/β)、MAPK激酶6(MAPKK6)等；糖代謝相關(guān)蛋白有磷酸果糖激酶-1同工酶B(PFK-B)及糖原合酶底物(glycogenin-1)2種。③在細(xì)胞整體水平上，在持續(xù)高濃度的EGF刺激下，不同EGF相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的磷酸化時(shí)間動(dòng)力學(xué)行為表現(xiàn)不同，大多數(shù)磷蛋白表現(xiàn)為峰型，其動(dòng)力學(xué)曲線最高峰值在5分或20分；但少數(shù)磷蛋白的動(dòng)力學(xué)行為卻表現(xiàn)為持續(xù)活化狀態(tài)，在120分鐘后仍處于較高的磷酸化水平，如Eps15和ERK2。

7、 結(jié)論：①在細(xì)胞整體水平，持續(xù)高濃度的EGF刺激下，小鼠肝細(xì)胞內(nèi)EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中大多數(shù)的磷蛋白都表現(xiàn)為激活后很快恢復(fù)到未刺激狀態(tài)。表明在細(xì)胞整體水平，信號(hào)途徑中磷蛋白表現(xiàn)的動(dòng)力學(xué)行為是受到整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)整合后的動(dòng)力學(xué)行為。從而可以認(rèn)為，EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間存在廣泛的相互作用及相互交流，并且這種相互作用對(duì)其最終生理效應(yīng)有影響；②EGF在生理濃度下可能表現(xiàn)為自適應(yīng)控制作用而正常發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、增殖和分