京尼平苷酸抗佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞炎癥及其MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的機(jī)制研究.pdf

1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)慢性自身免疫性疾病，以滑膜組織炎性增生、關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞為特征。該病遍布世界各地，各個(gè)種族均有發(fā)病。RA的傳統(tǒng)治療藥物主要包括非甾體類抗炎藥、抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、植物藥、腫瘤壞死因子α拮抗劑等幾大類。目前臨床上應(yīng)用的藥物主要用于控制和緩解RA癥狀，且存在較多的不良反應(yīng)，所以尋找高效低毒治療RA的新藥是今后研究的重要方向。我們前期研究發(fā)

2、現(xiàn)，中藥梔子具有顯著抗炎鎮(zhèn)痛作用，梔子浸膏及其單體京尼平苷酸明顯抑制RA大鼠足腫脹，提示該藥物對(duì)治療RA有較好的作用前景。其中京尼平苷酸(geniposidic acid，GA)，又名梔子苷酸，是一種環(huán)烯醚萜類化合物。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括ERK1/2、JNK1/2，P38共5條途徑，是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎慢性滑膜炎的典型特征。因此我們

3、猜測(cè)，京尼平苷酸治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能與此途徑有關(guān)。但京尼平苷酸如何作用于RA滑膜細(xì)胞、并進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)分泌和功能蛋白的表達(dá)，目前并不清楚，尚需揭示其作用機(jī)制，為進(jìn)一步將其篩選為有效藥物提供理論依據(jù)。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)主要分為四個(gè)部分:
　　第一部分實(shí)驗(yàn):用弗氏完全佐劑建立大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎（AA）模型并分離培養(yǎng)成纖維樣滑膜細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道FLS在體外培養(yǎng)后能夠穩(wěn)定增生。我們?nèi)〉?代成

4、纖維樣滑膜細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定;
　　第二部分實(shí)驗(yàn)分為5組:對(duì)照組（1640培養(yǎng)基，不含藥物），京尼平苷酸高（終濃度為1×10-5 mol·L-1）、中（終濃度為1×10-6 mol·L-1）、低（終濃度為1×10-7 mol·L-1）給藥組和甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)陽(yáng)性對(duì)照藥組（終濃度為1×10-6 mol·L-1）。給予藥物干預(yù)后，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。分別在加入藥物24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)用MTT法檢測(cè)細(xì)

5、胞增殖情況，用Hoechst33342和PI雙染熒光顯微鏡觀察給予不同濃度GA后凋亡和壞死的成纖維樣滑膜細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　第三部分試驗(yàn):研究京尼平苷酸對(duì)細(xì)胞上清液細(xì)胞因子的影響。分別用ELISA法測(cè)定給藥后細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10的含量。通過檢測(cè)各類細(xì)胞因子含量的變化探討京尼平苷酸對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用機(jī)制;
　　第四部分實(shí)驗(yàn):研究京尼平苷酸對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞的Ras-MAPKS途徑的影響

6、。用RT—PCR法檢測(cè)JNK、ERK、P38基因mRNA表達(dá)，用western blotting檢測(cè)磷酸化的JNK、ERK、P38蛋白表達(dá)的影響，從細(xì)胞膜信號(hào)傳導(dǎo)途徑探討京尼平苷酸在RA中的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA模型建立成功:大鼠在用弗氏完全佐劑注射后第14天開始出現(xiàn)足部紅腫。炎癥出現(xiàn)的高峰期是在免疫后的第25天。大鼠逐漸開始出現(xiàn)活動(dòng)障礙，并可見足部、尾根部“關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)”。將關(guān)節(jié)炎指數(shù)3分以上的大

7、鼠脫臼處死，取大鼠病變部位關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行分離與培養(yǎng)。培養(yǎng)后的第3代成纖維樣滑膜細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到95％以上，符合實(shí)驗(yàn)要求，原代細(xì)胞培養(yǎng)理想。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，京尼平苷酸高濃度組(10-5 mol· L-1)能夠抑制滑膜細(xì)胞增殖，較之模型對(duì)照組比較明顯降低(P＜0.05);京尼平苷酸高濃度組(10-5 mol·L-1)、京尼平苷酸中濃度組(10-6 mol·L-1)能夠促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡，較之模型對(duì)

8、照組比較明顯降低(P＜0.05)。
　　第三部分試驗(yàn)細(xì)胞因子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn):加京尼平苷酸藥物后，治療組細(xì)胞上清液中京尼平苷酸高濃度組（10-5 mol·L-1），京尼平苷酸中濃度組(10-6 mol·L-1)中的IL-1β、TNF-α的含量較之模型對(duì)照組比較明顯降低(P＜0.05);京尼平苷酸高濃度組(10-5 mol·L-1)中的IL-10的含量明顯上調(diào)。
　　第四部分試驗(yàn)由RT-PCR結(jié)果可以看出:京尼平苷酸高濃度組(10-

9、5mol·L-1)，京尼平苷酸中濃度組(10-6 mol·L-1)能夠抑制JNK、ERK、P38基因mRNA表達(dá)。由western blotting結(jié)果可以看出:京尼平苷酸高濃度組(10-5 mol·L-1)，京尼平苷酸中濃度組(10-6 mol·L-1)能夠抑制磷酸化JNK、ERK、P38蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、足夠量濃度的京尼平苷酸能夠抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增生，促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡。
　　2、足夠

10、量濃度的京尼平苷酸對(duì)于成纖維樣滑膜細(xì)胞的上清液中IL-1β、TNF-α的含量起到抑制分泌作用，對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞的上清液中IL-10的含量起到刺激分泌的作用。
　　3、足夠量濃度的京尼平苷酸能抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞中磷酸化的JNK、ERK、P38-MAPKs蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　綜合以上四部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)京尼平苷酸對(duì)于AA有很好的治療作用，可以明顯抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡。抑制成纖維樣