甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌臨床分離株的分子分型及耐藥性分析.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，簡稱金葡菌，不僅是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的重要病原菌，而且在社區(qū)獲得性感染中，金葡菌也是引起皮膚、軟組織等感染的主要原因。金葡菌的致病作用多樣，可引起多種感染性疾病，從輕度的皮膚、軟組織感染到危及生命的敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎等，嚴重危害人類健康。金葡菌除可以表達多種毒力因子致病外，更為人們所忌憚的是其對抗生素耐藥的快速形成能力。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，特別是廣譜抗生素的使用，

2、金葡菌的耐藥形勢日益嚴峻，耐3種以上抗生素的多重耐藥菌檢出比例越來越高。
　　以往的研究大多關(guān)注于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus，MRSA)，然而仍然有相當部分的感染是由甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptible S.aureus，MSSA)引起，在我國MSSA感染約占金葡菌感染的40％，但是對于MSSA的分子特征還缺乏了解。在分子型別上，與M

3、RSA相比，MSSA表現(xiàn)出更高的遺傳多樣性。在特定地區(qū)，MSSA的流行無明顯的優(yōu)勢克隆，常常多種分子型別的菌株并存，我國不同的研究中報道的主要MSSA型別也存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，MSSA攜帶的多種毒力因子，如腸毒素、殺白細胞素等的表達水平比MRSA高。此外，MSSA菌獲得SCCmec耐藥盒后即轉(zhuǎn)化為MRSA，是MRSA的重要來源。一般認為，MSSA對除青霉素外的大多數(shù)抗生素敏感，然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)MSSA的耐藥水平逐年升高，多重耐藥菌株

4、檢出率持續(xù)上升。
　　分析MSSA臨床菌株的分子特征和耐藥表型對于鑒定菌株間親緣關(guān)系、有效控制MSSA的感染和傳播具有重要現(xiàn)實意義。在我國，MSSA感染仍然占金葡菌感染的40％左右，然而，現(xiàn)有的研究報道常與對MRSA的分析同時進行，以MRSA為主，尚未見專門針對MSSA的研究報道，對MSSA的分子特征所知有限。本研究對2012年6月至2013年12月期間收集于重慶和烏魯木齊兩座城市的115株MSSA臨床菌株進行了研究，綜合運用多種

5、分子分型方法，分析菌株的分子特征，在此基礎(chǔ)上對菌株的抗生素耐藥譜進行檢測，探討菌株分子特征與耐藥表型之間的關(guān)系。所得結(jié)果不僅可以在一定程度上揭示我國MSSA的流行現(xiàn)狀，探討其分子特征與耐藥表型的關(guān)系，也可以豐富我國金葡菌的分子流行病學資料，為進一步研究金葡菌耐藥機制，指導臨床抗生素合理應(yīng)用，防控金葡菌感染提供重要實驗依據(jù)。
　　主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　1.MSSA的分子分型研究
　　(1)葡萄球菌A蛋白基因多

6、態(tài)性分析(spa分型):用PCR方法擴增spa基因的X區(qū)，測序后獲得連續(xù)的24bp重復(fù)序列，從數(shù)據(jù)庫(http://spaserver.ridom.de/)中得到每個24bp重復(fù)序列相對應(yīng)的編號，再根據(jù)編號和排列順序確定菌株的spa型別。結(jié)果115株MSSA菌株共獲得45個spa型別，主要型別有t11413(8.7％，10株)、t571(6.1％，7株)和t7164(6.1％，7/115)，這三種型別占所有菌株的20.9％，另有11株可

7、能為新的spa型別。
　　(2)多位點序列分析(MLST分型):根據(jù)金葡菌7個管家基因(arc，aroE，glpF, gmk,pta，tpi，yqiL)的多態(tài)性確定其型別。首先分別PCR擴增每株菌的7個管家基因，測序后提交數(shù)據(jù)庫(http://saureus.mlst.net/)獲得每個管家基因的序號，然后按順序依次排列，獲得其ST型別，與已知的金葡菌流行株進行比較。115株MSSA菌可分為26個ST型，其中主要型別有ST121(

8、11.3％，13株)、ST15(11.3％，13株)、ST7(10.4％，12株)、ST22(10.4％，12株)、ST398(7.0％，8株)、ST188(6.1％％，7株)以及ST88(5.2％，6株)，占所有MSSA菌株的61.7％。
　　(3)金葡菌附屬基因調(diào)節(jié)子（agr）分型:金葡菌agr位點的可變區(qū)包含編碼AgrD的基因序列、編碼AgrB的C末端2/3的序列和編碼AgrC的N末端的部分序列。不同金葡菌菌株的agr位點可

9、變區(qū)呈現(xiàn)出多態(tài)性，利用這一點可將金葡菌分為4種不同的agr型別。115株MSSA菌株共檢出agrⅠ型71株(61.7％)、agrⅡ型17株(14.8％)、agrⅢ型13株(11.3％)、agrⅣ型14株(12.2％)。
　　(4)脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型:先將金葡菌包埋于瓊脂中，然后用適當?shù)膬?nèi)切酶在原位對細菌的整個染色體進行酶切，電泳時通過不斷交替變換電場方向和脈沖時間，使酶切片段在電泳系統(tǒng)中得到較好的分離，最后電泳結(jié)果進行

10、聚類分析。結(jié)果107株MSSA分離株可分為10個聚類組，依次命名為A-J，其中A型(26.2％，28/107)、B型(26.2％，28/107)和F型(23.4％，25/107)為優(yōu)勢型別，占所有MSSA菌株的75.8％(81/107)。8株ST398型菌株無法分型。
　　(5)殺白細胞毒素毒力基因(pvl)檢測:115株MSSA中有33株顯示pvl基因陽性，陽性率為28.7％。
　　2.MSSA的耐藥性分析
　　檢測

11、了115株MSSA對13種臨床常用抗生素的耐藥情況，結(jié)果所有菌株對苯唑西林，利奈唑胺，萬古霉素，替考拉寧都敏感;僅有1株對利福平中介耐藥;對復(fù)方新諾明(28.7％，33/115)、四環(huán)素(18.3％，21/115)、慶大霉素(7.8％，9/115)、環(huán)丙沙星(5.2％，6/115)、左氧氟沙星(2.6％，3/115)呈不同程度的低水平耐藥;而對青霉素(83.4％，96/115)、紅霉素(60.0％，69/115)和克林霉素(51.3％，

12、59/115)呈高水平耐藥。通常將對3類以上（含3類）抗生素耐藥的細菌定義為多重耐藥菌(multidrug-resistant，MDR)。我們的檢測表明47.8％(55/115)的MSSA菌株為MDR菌株，其中大多數(shù)(89.1％，49/55)至少對青霉素、紅霉素和克林霉素3種抗生素耐藥。用PCR方法檢測所有MSSA菌株這3種抗生素耐藥基因的攜帶情況，結(jié)果青霉素耐藥基因blaZ的攜帶率為91.3％(105/115)，紅霉素、克林霉素耐藥基

13、因ermA、ermC攜帶率分別為30.4％(35/115)、92.2％(106/115)。
　　結(jié)合MSSA菌株的分子特征來看，4株ST943型菌都為MDR菌株;13株ST121型菌中有9株為MDR菌株(69.2％)，而且大多數(shù)(88.9％，8/9)有共同的耐藥譜(PEN-ERY-CLI);3株ST398型MDR菌株都對至少4類抗生素耐藥。此外，大多數(shù)(76.0％，19/25)PFGE F型菌株屬于多重耐藥菌，其中包含一株(ST4

14、5-t1081)對7種抗生素耐藥。
　　綜上所述，本研究通過分子分型分析揭示了我國重慶及烏魯木齊地區(qū)MSSA的主要種群結(jié)構(gòu)，通過耐藥性分析發(fā)現(xiàn)了較高的MDR檢出率。所分析的MSSA臨床菌株具有高度的遺傳多樣性，優(yōu)勢流行克隆不明顯，除國內(nèi)經(jīng)常存在的t571外，t11413和t7164也占據(jù)一定地位。具有高毒力、高耐藥性的ST121克隆在我國以往的報道中少見，在本研究中具有一定優(yōu)勢，值得高度關(guān)注。上述結(jié)果為了解MSSA的流行病學特征提