調(diào)理肝腎周期用藥對小鼠月經(jīng)樣出血模型影響的初步研究.pdf

1、任何一個(gè)環(huán)節(jié)的障礙將導(dǎo)致整個(gè)月經(jīng)周期發(fā)生病理性改變。針對小鼠月經(jīng)樣出血模型的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究包括子宮角的蛻膜化狀態(tài)，血清中激素的變化，炎性因子的表達(dá)，血管的變化，崩解相關(guān)的調(diào)控因子(Matrix Metallo Preteinases，MMP)表達(dá)的變化，以及核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factorκB，NF-κB)等多種途徑參與了內(nèi)膜組織胞外基質(zhì)的降解，即子宮內(nèi)膜的剝脫、出血。本研究在成功復(fù)制小鼠月經(jīng)樣出血模型的基礎(chǔ)上首次用中藥進(jìn)行干

2、預(yù)，觀察周期用藥對子宮內(nèi)膜不同時(shí)期的影響。檢測子宮的外觀形態(tài)變化;子宮系數(shù);陰道細(xì)胞涂片檢測紅細(xì)胞變化;放射免疫法檢測血清中雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)水平的變化;免疫組化、蛋白免疫印跡法(Western blot)、實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time polymerase Chain Reaction，Real-time PCR)法檢測子宮內(nèi)膜組織在增殖與分泌期的雌激素受體(es

3、tradiol receptorα，ER-α)、孕酮受體(progesterone receptor，PR)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR2)的變化;觀察月經(jīng)期即子宮內(nèi)膜的崩解期MMP3、MMP9以及NF-κB中P50與P65質(zhì)蛋白、核蛋白的表達(dá)變化。以子宮內(nèi)膜

4、的不同時(shí)期為界，從組織、分子、基因水平研究調(diào)理肝腎周期用藥對子宮內(nèi)膜的作用機(jī)制。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 調(diào)理肝腎周期用藥的探討
　　目的:研究調(diào)理肝腎周期用藥的理論基礎(chǔ)，分期原則，組方原則以及本研究所用方劑、應(yīng)用方法的基源。
　　方法:中醫(yī)學(xué)的月經(jīng)是"腎氣-天癸-沖任-胞宮"的機(jī)制與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)即下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamus-pituitary-ovary axis，

5、H-P-O axis)的調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的周期性變化是相對應(yīng)的。根據(jù)月經(jīng)周期性變化的特點(diǎn)對月經(jīng)性疾病的治療的意義在于能夠明確的調(diào)整子宮內(nèi)膜的狀態(tài)，使其順應(yīng)增殖、分化、崩解和修復(fù)的周期性變化規(guī)律。
　　結(jié)論:依據(jù)月經(jīng)周期性變化的特點(diǎn)提出了調(diào)理肝腎周期用藥，對月經(jīng)性疾病的治療具有重要的臨床與科研意義。
　　第二部分 調(diào)理肝腎周期用藥對月經(jīng)樣出血模型小鼠子宮形態(tài)學(xué)影響
　　目的:觀察調(diào)理肝腎周期用藥對小鼠的子宮角外觀、子宮系數(shù)、

6、子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)等影響，以探討周期用藥對子宮內(nèi)膜增殖、分泌、崩解的周期性變化影響。
　　方法:
　　1.動物分組與模型復(fù)制。
　　2.給藥方法。
　　3.取材點(diǎn)設(shè)計(jì)。
　　4.指標(biāo)檢測。
　　結(jié)果:(1)小鼠一般狀況:小鼠手術(shù)創(chuàng)面恢復(fù)良好，精神狀態(tài)佳，反應(yīng)靈敏，毛色有光澤，每日進(jìn)食、水量穩(wěn)定，激素給予前后小鼠體重穩(wěn)定。開腹后，子宮角結(jié)扎處未見明顯的炎性反應(yīng)，子宮角狀態(tài)良好。(2)子宮角外觀形態(tài):隨時(shí)間的

7、變化，假手術(shù)小鼠的子宮角外觀未見明顯改變;對照組實(shí)驗(yàn)側(cè)在單純E2作用下的T1點(diǎn)，肉眼下可見小鼠子宮角腫大，內(nèi)有液體充盈，外周血管密集、清晰可見;在E2、P聯(lián)合作用下的T2點(diǎn)，整個(gè)子宮體呈現(xiàn)紅色，而管腔未見明顯腫大;0h點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)側(cè)子宮角呈現(xiàn)淡紅色，管腔增粗腫大，8h點(diǎn)與0h相比，變化不明顯，到16h實(shí)驗(yàn)側(cè)子宮角顏色加深呈暗紅色，管腔明顯增粗腫脹，24 h到32h，實(shí)驗(yàn)側(cè)子宮角充血的顏色現(xiàn)暗紫色，管腔腫脹的程度減低。與對照組同時(shí)間點(diǎn)相比，中

8、藥組實(shí)驗(yàn)側(cè)子宮角呈現(xiàn)相似的變化趨勢，但在時(shí)間點(diǎn)的變化上與對照組有明顯差異，0h的變化與對照組的8h相似，12h管腔腫脹的程度最明顯，且整個(gè)出血過程明顯縮短，32h點(diǎn)實(shí)驗(yàn)側(cè)子宮角明顯呈現(xiàn)修復(fù)的改變。(3)陰道細(xì)胞涂片情況:隨時(shí)間變化，假手術(shù)組未檢出紅細(xì)胞;0、8h對照組沒有檢測到紅細(xì)胞，從12h陽性小鼠的比率增加，24h達(dá)87.5％，32h為88.9％，涂片的紅細(xì)胞數(shù)量24h最高;中藥組在0h即有紅細(xì)胞存在，16h、24h到達(dá)87.5％、

9、77.8％，32h明顯下降，涂片的紅細(xì)胞數(shù)量16h為最高點(diǎn)，與對照組比較子宮內(nèi)膜崩解的速度明顯增加，時(shí)程也明顯縮短。(4)子宮系數(shù)變化:與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，對照組在T1-T2點(diǎn)兩側(cè)子宮系數(shù)均顯著性增加(P＜0.05)，蛻膜化后0h-32h左側(cè)（實(shí)驗(yàn)側(cè)）子宮系數(shù)顯著性增加(P＜0.05)，右側(cè)（對照側(cè)）子宮系數(shù)無明顯差異(P＞0.05);在蛻膜化后0h-32h的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對照組與中藥組左側(cè)比右側(cè)明顯增加(P＜0.05);對照組在16

10、h到最高值，中藥組的最高值在12h;與對照組比較，中藥組左側(cè)子宮系數(shù)在T1-12h顯著增加(P＜0.05)，在32h則明顯減小(P＜0.05)。(5)子宮組織形態(tài)學(xué)變化:隨時(shí)間的變化，假手術(shù)組小鼠子宮角在整個(gè)過程中上皮完整，功能層細(xì)胞排列緊密，間質(zhì)細(xì)胞無明顯變化，說明未發(fā)生蛻膜化樣改變。在E2作用下T1點(diǎn)，子宮內(nèi)膜呈單層上皮結(jié)構(gòu)，核質(zhì)較高，細(xì)胞核呈橢圓狀，基質(zhì)疏松。而在E2、P聯(lián)合作用下的T2點(diǎn)，內(nèi)膜呈假復(fù)層改變，見分泌細(xì)胞，與模組性比

11、較，中藥組小鼠的子宮內(nèi)膜變化更明顯。孕酮撤退后，在0h子宮腔由于間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化內(nèi)膜增厚使宮腔狹窄，細(xì)胞肥大，胞漿紅染;8h則近宮腔處間質(zhì)蛻膜細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)，核固縮，染色質(zhì)致密;12h到16h，間質(zhì)中有白細(xì)胞浸潤，蛻膜化間質(zhì)壞死并伴有出血;24h到32h，脫落的間質(zhì)細(xì)胞呈壞死變化，較多白細(xì)胞浸潤，大量的壞死組織涌現(xiàn)，子宮內(nèi)膜崩解脫落。中藥組實(shí)驗(yàn)側(cè)的子宮組織變化趨勢與對照組相似，但在時(shí)間點(diǎn)的變化上與對照組有明顯差異，

12、0h的變化與對照組的8h相似，且胞漿大量紅染，12h的出血量最多，16h崩解的內(nèi)膜與基底層的界限清晰，32h則呈現(xiàn)腔上皮有乳頭狀增生，內(nèi)膜層有明顯的修復(fù)變化。(6)子宮內(nèi)膜崩解時(shí)程變化:與對照組比較，中藥組小鼠子宮各參數(shù)表現(xiàn)出與對照組相似的變化趨勢，但中藥組的峰值比對照組提前了4h，且32h時(shí)間點(diǎn)觀察到有明顯的內(nèi)膜修復(fù)特征，說明活血方能夠明顯的縮短子宮內(nèi)膜的崩解時(shí)程。
　　結(jié)論:周期用藥中補(bǔ)腎方能夠明顯促進(jìn)子宮內(nèi)膜在增殖期的增殖變

13、化;調(diào)肝方能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜向分泌期的轉(zhuǎn)化;活血方能夠加速子宮內(nèi)膜的剝脫，并明顯縮短崩解時(shí)程。
　　第三部分 調(diào)理肝腎周期用藥對其增殖期、分泌期子宮內(nèi)膜E2、P、VEGF及其受體的影響
　　目的:通過觀察激素(E2、P)、受體(ER-α、PR)以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF/VEGFR2)的變化研究周期用藥中補(bǔ)腎方、調(diào)肝方對子宮內(nèi)膜增值與分化作用的相關(guān)性。
　　方法:動物分組、模型復(fù)制同第二部分，給藥為補(bǔ)腎方與調(diào)肝方。采

14、用放射免疫法測定血清中E2、P的含量，免疫組化、蛋白免疫印跡法(Western blot)與Real-time PCR方法檢測子宮組織ER-α、PR、VEGF/VEGFR2蛋白與mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)血清中E2、P的含量比較:與假手術(shù)比較，對照組血清中E2、P的含量均顯著性升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與對照組比較，中藥組血清中E2、P的含量增加，但沒有顯著性差異(P＞0.05)。(2)免疫組化檢測ER-α

15、、PR、VEGF/VEGFR2表達(dá)的變化。(3)Westernblot檢測ER-α、PR、VEGF/VEGFR2蛋白表達(dá)比較。(4)Real-time PCR檢測ER-α、PR、VEGF/VEGFR2mRNA的比較。
　　結(jié)論:補(bǔ)腎方、調(diào)肝方分別調(diào)節(jié)了子宮內(nèi)膜增殖期、分泌期的狀態(tài)和功能，其機(jī)制并不是單純的增加血清激素的含量，而可能是上調(diào)了組織中ER-α、PR與VEGF/VEGFR2的表達(dá)。
　　第四部分 調(diào)理肝腎周期用藥中活

16、血方對月經(jīng)期崩解因子MMP3、MMP9表達(dá)時(shí)相的影響
　　目的:通過觀察MMP3與MMP9的表達(dá)時(shí)相變化，探討周期用藥中活血方對子宮內(nèi)膜崩解時(shí)程影響的作用機(jī)制。
　　方法:動物分組、模型復(fù)制同第二部分，給藥為活血方。采用免疫組化、Western blot與Real-time PCR方法檢測子宮組織MMP3、MMP9蛋白與mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)免疫組化檢測MMP3、MMP9表達(dá)比較。(2)Western bl

17、ot檢測MMP3、MMP9表達(dá)的比較。(3)Real-time PCR檢測MMP3 mRNA、MMP9 mRNA表達(dá)的比較。
　　結(jié)論:活血方在子宮內(nèi)膜崩解前期(12h)使MMP3、MMP9的表達(dá)明顯上調(diào)，表達(dá)的峰值提前;而在崩解后期與修復(fù)早期(24h-32h)，則又使其表達(dá)下調(diào)，從而縮短了子宮內(nèi)膜的崩解時(shí)程。
　　第五部分 調(diào)理肝腎周期用藥中活血方對月經(jīng)期信號通路NF-κB表達(dá)的影響
　　目的:通過觀察NF-κB中p

18、50與p65核蛋白的表達(dá)變化，探討周期用藥中活血方對NF-κB通路活化與阻斷的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:動物分組、模型復(fù)制同第二部分，給藥為活血方。采用免疫組化、Western blot檢測子宮組織P50與P65核蛋白與質(zhì)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)免疫組化檢測P50、P65表達(dá)的比較。(2)Western blot檢測P50、P65表達(dá)的比較。
　　結(jié)論:活血方通過調(diào)節(jié)P50與P65入核與出核，達(dá)到迅速激活或阻斷信號通