Shewanella oneidensis對(duì)氨芐青霉素抗性的分子機(jī)制研究.pdf

1、Shewanella oneidensis是屬于γ-變形菌綱的兼性厭氧菌，具有還原多種有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的能力?；诖?，目前S.oneidensis已成為研究環(huán)境污染物的氧化還原及其分子機(jī)制的模式菌株。同樣被人熟知的是，該菌對(duì)氨芐青霉素具有天然抗性。然而，我們?cè)谘芯恐幸馔獍l(fā)現(xiàn)S.oneidensis對(duì)氨芐青霉素的反應(yīng)獨(dú)特:中濃度（0.49～6.25μg/mL）比高濃度的氨芐青霉素對(duì)生長(zhǎng)的抑制效果更好。為了找出該現(xiàn)象的科學(xué)解釋?zhuān)疚膶?duì)S.on

2、eidensis產(chǎn)生氨芐青霉素抗性的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，其結(jié)果如下:S.oneidensisβ-內(nèi)酰胺酶BIaA的表達(dá)水平與氨芐青霉素引發(fā)的細(xì)胞裂解相關(guān)
　　 利用形成于氣液界面的生物被膜形成體系和抗生素敏感性試驗(yàn)檢測(cè)了S.oneidensis對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的響應(yīng)。研究表明，只有當(dāng)氨芐青霉素濃度范圍在0.49～6.25μg/mL時(shí)，S.oneidensis生物被膜的形成才會(huì)推遲。通過(guò)檢測(cè)該菌在氨芐青霉素中的生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)低濃度

3、抗生素引發(fā)的細(xì)胞裂解導(dǎo)致了生物被膜形成的延遲。盡管S.oneidensis基因組中含有7個(gè)可能編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因，但基因突變分析表明該菌對(duì)氨芐青霉素產(chǎn)生抗性只與其中一個(gè)β-內(nèi)酰胺酶相關(guān):BlaA。高濃度氨芐青霉素能有效誘導(dǎo)BlaA的表達(dá)，而低濃度抗生素?zé)o此能力，顯示其引發(fā)的細(xì)胞裂解很大程度上是由于BlaA表達(dá)量不足。研究結(jié)果還表明，細(xì)菌中含量最多的低分子量青霉素結(jié)合蛋白PBP5在細(xì)菌對(duì)抗氨芐青霉素時(shí)發(fā)揮重要作用。PBP5除作為β-內(nèi)

4、酰胺類(lèi)抗生素的“陷阱”外，還可能通過(guò)未知的信號(hào)途徑調(diào)控BlaA的表達(dá)。
　　 金屬離子對(duì)S.oneidensis氨芐青零素抗性的影響
　　 EDTA加劇由低濃度氨芐青霉素引發(fā)的細(xì)胞裂解，而大多數(shù)金屬離子對(duì)細(xì)胞裂解具有緩和作用。利用抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金屬離子能增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素的抗性，尤以Zn2+的效果最為顯著。Zn2+對(duì)細(xì)菌抗性的增強(qiáng)作用依賴(lài)于β-內(nèi)酰胺酶BIaA的產(chǎn)生，但并非通過(guò)增強(qiáng)金屬β-內(nèi)酰胺酶活性和提高bla

5、A基因表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。更為可能的機(jī)制是，金屬離子降低了細(xì)胞外膜通透性致使抗生素難以進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)空間，盡管外膜孔蛋白SO0312和SO3060的缺失并不影響Zn2+對(duì)細(xì)菌抗性的增強(qiáng)作用。此外，金屬離子還能影響細(xì)菌對(duì)其它多種抗生素的敏感性。S.oneidensis blaA基因表達(dá)的調(diào)控
　　 通過(guò)比較不同突變株中blaA基因啟動(dòng)子PblaA的活性和對(duì)氨芐青霉素的敏感性發(fā)現(xiàn)，BlaA表達(dá)的調(diào)控與已經(jīng)系統(tǒng)研究的β-內(nèi)酰胺酶AmpC（Ci

6、trobacterfreundii）的表達(dá)調(diào)控顯著不同，但二者都與肽聚糖循環(huán)密切相關(guān)。與AmpC的表達(dá)調(diào)控正相反，S.oneidensis中通透酶AmpG的失活引起B(yǎng)laA表達(dá)顯著提高，使細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素產(chǎn)生超強(qiáng)抗性。為了找出影響blaA表達(dá)的基因，構(gòu)建了可以直接通過(guò)觀察菌落顏色反映細(xì)胞中BlaA表達(dá)水平的菌株WT/P blaA-lacZ。以WT/P blaA-lacZ菌株為親本，利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)篩選獲得了9個(gè)blaA表達(dá)顯著增強(qiáng)

7、的突變株。經(jīng)轉(zhuǎn)座位點(diǎn)確定和序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)主要集中于mrcA和忉C。mrcA和lppC分別編碼高分子量青霉素結(jié)合蛋白PBP1a和外膜脂蛋白LppC，其中LppC與Escherichia coli的PBP1a伴侶蛋白LpoA具有很高的同源性。S.oneidensis中LppC很有可能與PBP1a形成復(fù)合體參與肽聚糖的合成?；诩?xì)胞不能同時(shí)缺失PBP1a-LpoA和PBP1b-LpoB，通過(guò)構(gòu)建合成致死突變株，編碼S.one

8、idensis的PBP1b-LpoB的基因被確定。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S.oneidensis的PBP1a-LpoA和PBP1b-LpoB復(fù)合體的功能具有明顯差異:PBP1a-LpoA復(fù)合體與細(xì)菌正常生長(zhǎng)有關(guān)，更重要的是，這個(gè)復(fù)合體的缺失引起B(yǎng)laA組成型高表達(dá)，使細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素產(chǎn)生超強(qiáng)抗性;而PBP1b-LpoB復(fù)合體對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和氨芐青霉素抗性都沒(méi)有影響。此外，由mrcA缺失引起的BlaA高表達(dá)與通透酶AmpG無(wú)關(guān)，表明誘導(dǎo)blaA表達(dá)