轉(zhuǎn)基因水稻中標(biāo)記基因水平轉(zhuǎn)移評(píng)價(jià)的系統(tǒng)生物學(xué)方法研究.pdf

1、標(biāo)記基因目前廣泛用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，隨著轉(zhuǎn)基因植物商品化種植，轉(zhuǎn)基因植物食品中標(biāo)記基因能否水平轉(zhuǎn)移至消化道微生物或上皮組織并成功結(jié)合和表達(dá)，成為需要回答的潛在食品安全問(wèn)題之一。因此，開(kāi)展轉(zhuǎn)基因植物食品中標(biāo)記基因水平轉(zhuǎn)移研究成為轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要方面。
　　 潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin B phosphotransferase)基因(hpt)是一種常用的抗生素選擇標(biāo)記基因，它來(lái)自Streptomyces

2、Hygroscopicus的aph(4)-Ta基因編碼的氨基糖苷4-磷酸轉(zhuǎn)移酶。在植物轉(zhuǎn)化中，潮霉素抗性基因(hpt)的選擇效率在某些作物(如禾谷類)上較其他標(biāo)記基因高。我國(guó)科學(xué)家研制出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和產(chǎn)業(yè)化前景的轉(zhuǎn)sck水稻s86，所使用的標(biāo)記基因即為hpt。本研究以轉(zhuǎn)sck或sck+Bt基因水稻s86品系含hpt和去標(biāo)記產(chǎn)品為范例，利用基因穩(wěn)定性、缺失修復(fù)和蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，對(duì)標(biāo)記基因安全性評(píng)價(jià)方法進(jìn)行研究。
　　 ⑴利用

3、自行設(shè)計(jì)的定性PCR和實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增體系，對(duì)hpt在不同加工條件和體外模擬消化條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，以確定其發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的可能性是否存在。結(jié)果表明，加工米飯、粥大于500bp的片段已降解，爆米花和鍋巴大于236bp的hpt片段已降解。對(duì)照M86大米加工米飯和粥僅能擴(kuò)出植物葉綠體基因rbc1片段，爆米花、鍋巴及空白對(duì)照所有擴(kuò)增均為陰性。利用定性PCR體系和實(shí)時(shí)定量PCR體系對(duì)體外模擬消化道樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)加工和/或胃腸道

4、的作用以后，hpt基因已降解成較小片段，從量上來(lái)講絕大部分也已降解。表明hpt在轉(zhuǎn)基因大米加工食品中均已不同程度的發(fā)生了降解，不同加工方式對(duì)hpt片段降解影響顯著，經(jīng)過(guò)加工和/或胃腸道的作用以后，hpt基因已降解成較小片段，從量上來(lái)講絕大部分也已降解，以較大或完整片段向食品或消化道微生物轉(zhuǎn)移的可能性減小。
　　 ⑵自行構(gòu)建了基于同源重組的標(biāo)記修復(fù)系統(tǒng)開(kāi)展DNA的轉(zhuǎn)化能力研究。以含hpt缺失片段的受體菌E.coli JM109(重

5、組酶基因缺失的工程菌)和E.coli MG1655(野生型)為受體菌構(gòu)建標(biāo)記修復(fù)系統(tǒng)；以含完整hpt片段的PCR產(chǎn)物、轉(zhuǎn)sck基因水稻基因組DNA和供體質(zhì)粒對(duì)受體菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下沒(méi)有觀察到標(biāo)記修復(fù)的發(fā)生。用枯草桿菌構(gòu)建的標(biāo)記修復(fù)系統(tǒng)正在構(gòu)建中。
　　 ⑶建立了水稻2種組織樣品(大米和葉苗)和加工米飯蛋白樣品制備方法，以轉(zhuǎn)sck基因水稻、轉(zhuǎn)sck+Bt基因水稻、轉(zhuǎn)sck+Bt基因水稻(刪除hpt基因)及親本ck水稻為

6、研究對(duì)象，應(yīng)用PCR技術(shù)及雙向凝膠電泳(2DE)與基質(zhì)輔助激光誘導(dǎo)解離-串聯(lián)時(shí)間飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF)技術(shù)，對(duì)水稻葉苗、大米和米飯的蛋白質(zhì)組開(kāi)展了初步研究。經(jīng)過(guò)2DE后銀染膠的比對(duì)，在水稻葉苗、大米、米飯樣品分別與親本對(duì)應(yīng)樣品間不僅均有蛋白點(diǎn)表現(xiàn)為量和質(zhì)的變化，而且在各組內(nèi)蛋白點(diǎn)的變化與親本相比具有差異點(diǎn)顯現(xiàn)比較一致的特點(diǎn)，提示其可能與轉(zhuǎn)基因的操作有關(guān)。對(duì)轉(zhuǎn)sck+Bt大米(未去標(biāo)記)和親本M86大米進(jìn)行全蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)定

7、，結(jié)合銀染膠比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻中本身具有的4個(gè)蛋白OSJNBa0038O10.14(α-淀粉酶)、putative triosephosphate isomerase(假定的磷酸丙糖異構(gòu)酶)和glutelin(谷蛋白)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)；去標(biāo)記轉(zhuǎn)sck+Bt大米與親本比較顯現(xiàn)出更多差異，可能與標(biāo)記基因的剔除操作有關(guān)，其中的4個(gè)差異點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因水稻種子中存在外源基因hpt和sckt和Bt，但轉(zhuǎn)sck+Bt基

8、因水稻的全蛋白質(zhì)組質(zhì)譜鑒定結(jié)果并未檢測(cè)到這三個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物，其原因可能是由于水稻種子處于休眠狀態(tài)，基因轉(zhuǎn)錄水平低，從而導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平低。這也間接表明所評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻蛋白表達(dá)的選擇性，稻谷更加安全。
　　 在轉(zhuǎn)基因操作過(guò)程中，多個(gè)拷貝的外源基因或者基因片段經(jīng)常隨機(jī)插入作物原有基因中，有可能造成原有基因的缺失或重排，產(chǎn)生非期望效應(yīng)。這些效應(yīng)包括干擾或破壞原有基因功能，甚至發(fā)生基因沉默，形成新的代謝物或者改變已有代謝物水平，進(jìn)而有可