球孢白僵菌非核糖體多肽合成酶組的功能分析.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一種蟲生真菌，可以侵入6個目15個科的200多種昆蟲，并在蟲體內大量繁殖，同時產生白僵菌素和卵孢菌素等次生代謝產物，這些物質可引起昆蟲中毒，使其新陳代謝紊亂，最終導致昆蟲死亡。對于球孢白僵菌侵染昆蟲的作用機制，國內外的研究主要集中于研究其侵染的機理，但對其次生代謝產物的生物合成和生物學功能研究還不夠深入。非核糖體多肽（nonribosomal peptide，NRP）類化合物是真菌的主

2、要次生代謝產物。基因組分析表明，球孢白僵菌ARSEF2860中含有21個非核糖體多肽的合成基因，但目前只報道了4個基因的合成產物和生物學功能，如白僵菌素等，而大部分的非核糖體多肽的生物合成基因功能未知。為了研究這些未知基因的功能，本論文利用生物信息學的方法，系統(tǒng)地分析了球孢白僵菌ARSEF2860的21個非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)，并按功能將其分為3類，通過基因敲除和感染小

3、菜蛾實驗，確定了3個參與侵染小菜蛾過程的非核糖體多肽合成酶基因，具體結果如下:
　　1、antiSMASH和hmmsearch等次級代謝產物分析工具對球孢白僵菌ARSEF2860基因組進行檢索，獲得21個NRPS基因，和3個聚酮合酶-非核糖體多肽合成酶(polyketidesynthase-nonribosomal peptide synthase，PKS-NRPS)雜合基因。提取非核糖體多肽合成酶的腺苷酰化結構域(Adenyla

4、tion domain，A domain)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)聚類分析的結果，將球孢白僵菌的NRPS按功能分成3類:基礎代謝類（7個）、致病相關類（12個）和功能未知類（2個）。
　　2、在實驗室培養(yǎng)條件和侵染小菜蛾條件下，球孢白僵菌ARSEF2860的NRPS表達差異非常明顯，通過反轉錄PCR發(fā)現(xiàn)，BBA_08222（致病相關類）和BBA_03671（致病相關類）在侵染宿主過程中被激活，BBA_06727（致病相關類）和BBA_

5、04028（基礎代謝類）表達量增加。通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，包括基礎代謝類BBA_04028與致病相關類BBA_08222、BBA_03671和BBA_06727在內的10個NRPS基因在侵染第6天表達量上調，可能參與侵染過程。
　　3、根據(jù)熒光定量PCR和反轉錄PCR的結果，挑選在侵染小菜蛾期間表達量上調的NRPS基因BBA_04028（基礎代謝類）、BBA_08222（致病相關類）、BBA_03671（致病相關類）和BBA

6、_06727（致病相關類），利用同源雙交換策略進行敲除。突變株和野生型在PDA培養(yǎng)基上的生長發(fā)育沒有明顯的差異。在對小菜蛾幼蟲侵染的實驗中，BBA_04028、BBA_08222和BBA_03671這3個基因的缺失導致球孢白僵菌致病能力顯著下降(p＜0.05)，侵染6天后小菜蛾幼蟲的存活率分別為:31.9％，37.3％和54.7％，而野生型侵染后的存活率為10.6％。BBA_06727基因的缺失沒有顯著降低球孢白僵菌對小菜蛾的致病能力，