球孢白僵菌非核糖體多肽合成酶組的功能分析.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一種蟲(chóng)生真菌，可以侵入6個(gè)目15個(gè)科的200多種昆蟲(chóng)，并在蟲(chóng)體內(nèi)大量繁殖，同時(shí)產(chǎn)生白僵菌素和卵孢菌素等次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)可引起昆蟲(chóng)中毒，使其新陳代謝紊亂，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。對(duì)于球孢白僵菌侵染昆蟲(chóng)的作用機(jī)制，國(guó)內(nèi)外的研究主要集中于研究其侵染的機(jī)理，但對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的生物合成和生物學(xué)功能研究還不夠深入。非核糖體多肽（nonribosomal peptide，NRP）類(lèi)化合物是真菌的主

2、要次生代謝產(chǎn)物?；蚪M分析表明，球孢白僵菌ARSEF2860中含有21個(gè)非核糖體多肽的合成基因，但目前只報(bào)道了4個(gè)基因的合成產(chǎn)物和生物學(xué)功能，如白僵菌素等，而大部分的非核糖體多肽的生物合成基因功能未知。為了研究這些未知基因的功能，本論文利用生物信息學(xué)的方法，系統(tǒng)地分析了球孢白僵菌ARSEF2860的21個(gè)非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)，并按功能將其分為3類(lèi)，通過(guò)基因敲除和感染小

3、菜蛾實(shí)驗(yàn)，確定了3個(gè)參與侵染小菜蛾過(guò)程的非核糖體多肽合成酶基因，具體結(jié)果如下:
　　1、antiSMASH和hmmsearch等次級(jí)代謝產(chǎn)物分析工具對(duì)球孢白僵菌ARSEF2860基因組進(jìn)行檢索，獲得21個(gè)NRPS基因，和3個(gè)聚酮合酶-非核糖體多肽合成酶(polyketidesynthase-nonribosomal peptide synthase，PKS-NRPS)雜合基因。提取非核糖體多肽合成酶的腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(Adenyla

4、tion domain，A domain)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，根據(jù)聚類(lèi)分析的結(jié)果，將球孢白僵菌的NRPS按功能分成3類(lèi):基礎(chǔ)代謝類(lèi)（7個(gè)）、致病相關(guān)類(lèi)（12個(gè)）和功能未知類(lèi)（2個(gè)）。
　　2、在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件和侵染小菜蛾條件下，球孢白僵菌ARSEF2860的NRPS表達(dá)差異非常明顯，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)，BBA_08222（致病相關(guān)類(lèi)）和BBA_03671（致病相關(guān)類(lèi)）在侵染宿主過(guò)程中被激活，BBA_06727（致病相關(guān)類(lèi)）和BBA_

5、04028（基礎(chǔ)代謝類(lèi)）表達(dá)量增加。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，包括基礎(chǔ)代謝類(lèi)BBA_04028與致病相關(guān)類(lèi)BBA_08222、BBA_03671和BBA_06727在內(nèi)的10個(gè)NRPS基因在侵染第6天表達(dá)量上調(diào)，可能參與侵染過(guò)程。
　　3、根據(jù)熒光定量PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR的結(jié)果，挑選在侵染小菜蛾期間表達(dá)量上調(diào)的NRPS基因BBA_04028（基礎(chǔ)代謝類(lèi)）、BBA_08222（致病相關(guān)類(lèi)）、BBA_03671（致病相關(guān)類(lèi)）和BBA

6、_06727（致病相關(guān)類(lèi)），利用同源雙交換策略進(jìn)行敲除。突變株和野生型在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有明顯的差異。在對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)侵染的實(shí)驗(yàn)中，BBA_04028、BBA_08222和BBA_03671這3個(gè)基因的缺失導(dǎo)致球孢白僵菌致病能力顯著下降(p＜0.05)，侵染6天后小菜蛾幼蟲(chóng)的存活率分別為:31.9％，37.3％和54.7％，而野生型侵染后的存活率為10.6％。BBA_06727基因的缺失沒(méi)有顯著降低球孢白僵菌對(duì)小菜蛾的致病能力，