2型糖尿病患者骨鈣素與糖脂代謝的相關(guān)關(guān)系及高糖下sKlotho對成骨細胞代謝的影響.pdf

1、目的:糖尿病不但能夠?qū)е赂鞣N大、微血管并發(fā)癥，還能夠加重甚至引起骨量減少和骨質(zhì)疏松。糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是指糖尿病并發(fā)骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)改變，骨強度減低、脆性增加，易發(fā)生骨折等骨質(zhì)疏松表現(xiàn)的一種全身性、代謝性骨病。DOP可視為糖尿病慢性并發(fā)癥之一，但因其發(fā)病隱匿，既往人們對于DOP的認識不足，近年來由于糖尿病患者的逐年增加，DOP的發(fā)病率愈發(fā)增高，使糖尿病患者發(fā)生骨折風險大大增加，

2、致殘致死率高，醫(yī)療費用龐大，因此對DOP發(fā)病機制及防治靶點的深入探討具有積極的意義。
　　骨鈣素(osteocalcin，OC)是僅次于骨膠原蛋白的骨第二大分泌蛋白，是唯一的只由成骨細胞產(chǎn)生的基質(zhì)蛋白，OC與羥基磷灰石結(jié)晶結(jié)合儲存于骨基質(zhì)中，完成骨的礦化。OC被認為是成骨細胞分化和成熟的標志，是反映成骨細胞活性的敏感而特異的指標。高血糖能導致成骨細胞功能不全，成骨細胞分泌的OC減少，骨礦化不全，造成糖尿病患者骨質(zhì)疏松和骨折風險明顯

3、增加。而近期的研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)血中的OC還能夠參與調(diào)節(jié)糖脂代謝，因此本課題的第一部分研究旨在探討OC作為一種內(nèi)分泌調(diào)節(jié)激素與2型糖尿病患者糖脂代謝之間的關(guān)系。
　　衰老與糖尿病具有相似性，二者都屬于一種慢性炎性疾病，過多的晚期糖基化終末產(chǎn)物、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和炎癥因子的產(chǎn)生可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起骨代謝異常，導致老年性骨質(zhì)疏松癥和DOP的發(fā)生。因此，氧化應(yīng)激是老年性骨質(zhì)疏松癥與DOP共同

4、且重要的發(fā)病機制。在老年性骨質(zhì)疏松癥中發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator1，Sirt1)不僅能發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，還能夠通過調(diào)控衰老通路P53/P21及P16發(fā)揮抗衰老作用，改善骨代謝。而在DOP中尚無有關(guān)Sirt1及衰老通路作用的報道。
　　Klotho是一種抗衰老基因，Klotho基因敲除小鼠表現(xiàn)為壽命縮短和包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的多器官早衰現(xiàn)象。Klotho編碼的蛋白分為在特定器官內(nèi)

5、表達的膜型Klotho以及廣泛分布于體液中的分泌型Klotho(secreted Klotho，sKlotho)。多項研究已經(jīng)證實Klotho與骨代謝之間存在聯(lián)系，有關(guān)Klotho在骨代謝中作用的研究都集中于膜型Klotho，認為膜型Klotho能作為纖維生長因子-23的輔因子調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝，從而間接影響骨代謝。而對于sKlotho在骨代謝中的作用及機制的研究尚無相關(guān)報道。在腫瘤、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)中均發(fā)現(xiàn)sKlotho具有抗氧化應(yīng)激的

6、作用，在血管內(nèi)皮細胞中還發(fā)現(xiàn)sKlotho能抑制P53/P21通路發(fā)揮抗衰老作用。但對于sKlotho能否在高糖下骨代謝中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激及抗衰老的作用及相關(guān)機制的研究尚無報道。因此，本課題第二部分研究旨在明確sKlotho對高糖下成骨細胞的作用，并深入探討sKlotho對高糖下成骨細胞中Sirt1及衰老通路的作用，為DOP的發(fā)病機制及防治提供新的靶點。
　　研究方法:第一部分2型糖尿病患者骨鈣素與糖脂代謝的相關(guān)關(guān)系
　　根據(jù)

7、1999年WHO的糖尿病診斷標準選擇我院2型糖尿病(type2 diabetesmellitus，T2DM)患者(行口服葡萄糖耐量試驗確診)985例，分為男性組495例，絕經(jīng)后女性組490例。均排除肝腎功能損傷;糖尿病急性并發(fā)癥，惡性腫瘤，骨折史時間小于1年，閉經(jīng)時間小于1年，骨質(zhì)疏松，甲狀腺疾病、甲狀旁腺疾病及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，近期感染、手術(shù)、創(chuàng)傷等其他應(yīng)激情況，孕婦，應(yīng)用噻唑烷二酮類、雙膦酸鹽類、降鈣素、糖皮質(zhì)激素、雌激素、維生素

8、D、鈣劑、華法林、維生素K等影響骨代謝藥物者，應(yīng)用降脂藥物者。
　　所有受試者均過夜空腹12h，次日晨起采集靜脈血于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科及內(nèi)分泌研究所測定空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹胰島素(FINS)、空腹C肽(FCP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、鈣(Ca)、磷(P)、甲狀旁腺素(PTH)、25羥維生素D3(25(OH)

9、VD3)、堿性磷酸酶(ALP)、OC、血清總Ⅰ型膠原氨基端延長肽(P1NP)、Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列(β-CTx)。用HOMA2軟件評估胰島β細胞功能(HOMA-β)和胰島素抵抗(HOMA-IR)。測量受試對象的身高、體重、腰圍、臀圍，計算體重指數(shù)(BMI)及腰臀比(WHR)。BMI=體重(kg)/身高2(m2)，WHR=腰圍(cm)/臀圍(cm)。采用直線相關(guān)分析及多元逐步回歸分析OC與各糖脂代謝指標之間的相關(guān)性。
　　第二

10、部分高糖下sKlotho對成骨細胞代謝的影響
　　取5～9代對數(shù)生長期小鼠成骨細胞株(MC3T3-E1)，以細胞濃度為2×106個細胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)細胞待其貼壁融合40％～60％后用無血清1640培養(yǎng)基同步化24h，分組處理:(1)正常糖組（NG，5.6mmol/L葡萄糖），(2)高滲組(HM，5.6mmol/L葡萄糖+29.4mmol/L甘露醇)，(3)高糖組(HG，35mmol/L葡萄糖)，(4)NG+Klot

11、ho組，(5)HG+Klotho組，(6)NG+N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)組，(7)HG+NAC組，(8)NG+Sirt1-siRNA組，(9)HG+Klotho+Sirt1-siRNA組。
　　以外源性重組Klotho蛋白干預(yù)高糖培養(yǎng)的MC3T3-E1，應(yīng)用基因沉默技術(shù)干擾Sirt1的表達;培養(yǎng)24、48、72小時后采用CCK8試劑盒檢測細胞增殖;培養(yǎng)48h后采用流式雙染法(AnnexinⅤ F

12、ITC/PI)檢測細胞凋亡;培養(yǎng)48h后采用熒光探針 DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS;培養(yǎng)120h后采用ALP微板法檢測ALP活性;培養(yǎng)120h后采用Western Blot檢測成骨分化指標Runx2、OC和ALP的表達;培養(yǎng)72h后采用Western Blot檢測通路蛋白Sirt1、P53、ace-P53、P21及P16的表達水平。
　　結(jié)果:第一部分2型糖尿病患者骨鈣素與糖脂代謝的相關(guān)關(guān)系
　　1、男性組和絕經(jīng)后女性組間

13、的年齡、HDL-C、P1NP、OC、FBG、HbA1c、β-CTx差別有統(tǒng)計學意義。絕經(jīng)后女性組的年齡、HDL-C、P1NP、β-CTx和OC較男性組高，而FBG與HbA1c較男性組低。
　　2、直線相關(guān)分析結(jié)果顯示，兩組中OC均與HbA1c呈顯著負相關(guān)，男性組中OC與HOMA-β呈顯著正相關(guān)，但在絕經(jīng)后女性組中無相關(guān)性。兩組中OC與病程、FBG、FINS、FCP、HOMA-IR、HOMA-β、LDL-C、HDL-C、TG、BMI

14、、WHR、HOMA-IR、25(OH)VD3及PTH之間均無相關(guān)性。
　　3、多元逐步回歸分析結(jié)果顯示，兩組中OC均為影響HbA1c水平的獨立相關(guān)因素;男性組中OC是影響HOMA-β的獨立相關(guān)因素，但在絕經(jīng)后女性組中無相關(guān)性。
　　第二部分高糖下sKlotho對成骨細胞代謝的影響
　　1、高糖能抑制MC3T3-E1的增殖和分化功能，增加細胞凋亡率，增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，減少Sirt1的表達并激活衰老通路P53/P21

15、和P16。
　　行高糖濃度篩選后，發(fā)現(xiàn)35mmol/L葡萄糖濃度對MC3T3-E1的影響最顯著。用35mmol/L葡萄糖刺激細胞后，與NG組比較，CCK8試劑盒檢測細胞增殖發(fā)現(xiàn)高糖在刺激細胞48及72h后，細胞增殖較NG組明顯下降;Westem Blot法檢測分化蛋白ALP、Runx2及OC的表達提示高糖在刺激細胞120h后，ALP、Runx2及OC蛋白的表達較NG組明顯降低;流式雙染法檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)高糖在刺激細胞48h后，細胞

16、凋亡率較NG組明顯增加;熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS發(fā)現(xiàn)高糖在刺激細胞48h后，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生較NG組明顯增加;Western Blot法檢測通路蛋白Sirt1、P53、ace-P53、P21及P16的表達發(fā)現(xiàn)高糖在刺激細胞72h后，Sirt1的表達較NG組明顯減少，P53、ace-P53、P21及P16蛋白的表達較NG組明顯增加。
　　2、sKlotho能改善高糖下MC3T3-E1的增殖和分化功能，減少細胞凋亡，并

17、能抑制高糖下MC3T3-E1中衰老通路P53/P21和P16的激活。
　　行sKlotho濃度篩選后，發(fā)現(xiàn)0.2ug/ml的sKlotho濃度對高糖下MC3T3-E1細胞的作用最顯著。在高糖(35mmol/L)刺激下的MC3T3-E1中加入0.2ug/ml的Klotho重組蛋白干預(yù)后，與HG組比較，在sKlotho干預(yù)細胞72h后，細胞增殖較HG組明顯增加;在sKlotho干預(yù)細胞120h后，分化蛋白ALP、Runx2及OC的表達

18、較HG組明顯增加;在sKlotho干預(yù)細胞48h后，細胞凋亡率較HG組明顯減少;在sKlotho干預(yù)細胞72h后，衰老通路蛋白P53、ace-P53、P21及P16的表達較HG組明顯減少。
　　3、高糖能通過增加MC3T3-E1細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生減少Sirt1的表達，sKlotho對高糖下MC3T3-E1細胞功能的改善以及對高糖下衰老通路的逆轉(zhuǎn)是通過減少細胞內(nèi)ROS進而增加Sirt1的表達來實現(xiàn)的。
　　在高糖刺激下的MC3

19、T3-E1中加入抗氧化劑NAC后，與HG組比較，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生較HG組顯著減少，干預(yù)72h后，Sirt1的表達較HG組顯著增加;在高糖刺激下的MC3T3-E1中加入sKlotho后，與HG組比較，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生較HG組顯著減少，Sirt1的表達較HG組顯著增加;以基因沉默干擾技術(shù)抑制細胞中Sirt1的表達后，再來觀察sKlotho對高糖下MC3T3-E1的作用，與HG+Klotho組相比較，細胞增殖較HG+Klotho組明顯減少

20、，ALP、Runx2及OC蛋白的表達較HG+Klotho組明顯減少，細胞凋亡率較HG+Klotho組明顯增加，衰老通路蛋白P53、ace-P53、P21及P16的表達較HG+Klotho組明顯增加。
　　結(jié)論:1、在T2DM患者中，血清OC與糖代謝和β細胞功能之間存在相關(guān)性，而OC與胰島素抵抗和脂代謝之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)關(guān)系。
　　2、高糖能導致小鼠成骨細胞株MC3T3-E1功能紊亂，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少Sirt1的表達并引發(fā)細