臨床分離革蘭陽性菌整合子的研究.pdf

1、一直以來，在細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和傳播的基因機(jī)制中，研究者對(duì)耐藥性質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的研究比較多。近年，整合子一耐藥基因盒系統(tǒng)成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)，其在革蘭陰性菌中對(duì)細(xì)菌耐藥性的介導(dǎo)作用已經(jīng)得到逐步的確認(rèn)。而革蘭陽性菌作為一類重要的病原菌，研究者還沒有系統(tǒng)地展開整合子一耐藥基因盒系統(tǒng)在革蘭陽性菌中介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和傳播作用的研究。 為了探討整合子在革蘭陽性菌耐藥機(jī)制中的介導(dǎo)作用，對(duì)分離自廣州暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者臨床標(biāo)本的46株革

2、蘭陽性菌做三類整合子的篩選。首先研究了它們對(duì)13種常用抗菌藥物耐藥性情況。結(jié)果表明所有的菌株對(duì)其中至少一種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，且大部分的菌株(96％)對(duì)至少三種或以上的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。應(yīng)用多重PCR法檢測(cè)三類整合酶基因，發(fā)現(xiàn)46株菌均為第一類整合子陽性菌株，沒有菌株為第二、三類整合酶基因陽性。 以IN-F和IN-B對(duì)46株第一類整合子陽性菌株整合的耐藥基因盒進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，在46株第一類整合子陽性菌株中，有45株菌產(chǎn)生大約1

3、.9kb的片段，有1株菌(GHl85)產(chǎn)生兩個(gè)片段，大小分別為1.9 kb和1.0kb。隨機(jī)挑選了GHl35和GH263兩株菌的1.9 kb擴(kuò)增片段進(jìn)行DNA測(cè)序。首先把DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行凝膠純化，連接到pMDl8 T-載體，連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌E-coli DH50~，在含有100ug／ml氨芐青霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒后進(jìn)行DNA序列測(cè)定。序列分析的結(jié)果表明，1.9 kb的片段大小為1913 bp，含有耐藥基因盒d

4、h．廠，XII、未知功能的讀碼框架orfF和耐藥基因盒aadA2。dhfrFXII編碼二氫葉酸還原酶，介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)甲氧芐氨嘧啶的耐藥；aadA2編碼腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷類抗生素鏈霉素及壯觀霉素的耐藥。而對(duì)于GHl85擴(kuò)增得到的1.0kb片段，由于本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)沙門菌S-tshiongwe S191中第一類整合子相同大小的耐藥基因盒PCR擴(kuò)增片段(GenBank accession no．AY263741，含有耐藥基因盒a

5、adA2，數(shù)據(jù)已公開發(fā)表)進(jìn)行了測(cè)序，將以PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對(duì)其序列進(jìn)行分析。 對(duì)用IN—F和IN—B擴(kuò)增得到的46個(gè)1.9 kb的片段、1個(gè)1.0kb的片段和來自沙門菌S．tshiongwe S191的1.0kb的片段分別用BstP I、EcoR I和Sty I三種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行PCR．RFLP分析，得到相同限制性酶圖譜的片段則認(rèn)為是含有相同的耐藥基因盒。PCR．RFLP分析結(jié)果表明46個(gè)1

6、.9 kb的片段具有一樣的限制性酶圖譜，分別來自GH185和S.tshiongwe S191的兩個(gè)1.0kb的片段得到一致的限制性酶圖譜。故可推斷45株第一類整合子陽性菌株整合的耐藥基因盒均為dhfrXII-orfF-aadA2；GH185至少攜帶兩個(gè)拷貝的整合子，整合的耐藥基因盒分別為dhfrXII-orfF-aadA2和aadA2。本研究中，同種屬和不同種屬的病原菌中的第一類整合子攜帶相同的基因盒排列，結(jié)果提示存在醫(yī)院內(nèi)感染和病原菌