單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)甘脂預(yù)處理對布比卡因誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞神經(jīng)毒性的保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　本實驗研究模型均采用體外培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞，探討布比卡因(bupivacaine，bup)的神經(jīng)毒性以及單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)甘脂(gangliosides，GM-1)預(yù)處理后對布比卡因誘導(dǎo)的細(xì)胞神經(jīng)毒性時的保護(hù)作用及可能作用機制。為其應(yīng)用于神經(jīng)保護(hù)及今后臨床上藥物防治布比卡因引起的潛在神經(jīng)毒性提供一定的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)，尋求更為有效的治療方法。
　　方法:
　　所有試驗均采用小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤

2、細(xì)胞N2a細(xì)胞作為研究對象。
　?。ㄒ唬嶒灧纸M:
　　(1)實驗一:將細(xì)胞分為下述幾組:對照組（C組）:N2a細(xì)胞不進(jìn)行任何干預(yù)，布比卡因為0μmol/L;布比卡因組，N2a細(xì)胞與不同濃度布比卡因600、900、1200、1500、2000μmol/L(B1、B2、B3、B4、B5組)作用。
　　(2)實驗二:將細(xì)胞分為下列幾組:對照組（A組）:無布比卡因損傷及GM-1干預(yù);布比卡因組（B組）:布比卡因有效損傷濃度和

3、24h前無GM-1保護(hù);不同濃度的GM-1預(yù)保護(hù)組（BG組）:在布比卡因有效損傷濃度前24h預(yù)先在培養(yǎng)液中加入不同濃度GM-10.001、0.01、0.1、1、10μmol/L(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5組)。
　?。ǘ嶒炓?通過觀察不同濃度的布比卡因?qū)2a神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，找到最適合損傷濃度建立細(xì)胞損傷模型。
　　(1)評價指標(biāo):細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡率。
　　(2)試驗步驟:將N2a細(xì)胞分別與不同

4、濃度的布比卡因0、600、900、1200、1500、2000μmol/L（C、B1、B2、B3、B4、B5組）分別作用6h、12h、24h、36h。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;CCK-8法評價細(xì)胞存活率。每組實驗重復(fù)3次。
　?。ㄈ嶒灦?明確GM-1對布比卡因誘導(dǎo)N2a神經(jīng)細(xì)胞損傷的是否具有保護(hù)作用。闡述GM-1對布比卡因誘導(dǎo)N2a細(xì)胞損傷的可能保護(hù)機制。
　　(1)評價指標(biāo):細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞核固縮率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞凋

5、亡因子Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　(2)試驗步驟:將N2a細(xì)胞用不同濃度0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5組)的GM-1預(yù)處理24h后均再加入布比卡因(900μmol/L)繼續(xù)作用12h，建立好細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ?。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;采用CCK-8法評價N2a神經(jīng)細(xì)胞存活率;Hoechst33258熒光染色

6、法檢測細(xì)胞核固縮率;以流式細(xì)胞儀技術(shù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染方法檢測細(xì)胞凋亡率;以RT-PCR和Westernblot法測定不同濃度GM-1對損傷細(xì)胞神經(jīng)元caspase-3、csapase-8、caspase-9基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。每組實驗重復(fù)3次。
　　結(jié)果：
　　(1) CCK-8法檢測結(jié)果表明，布比卡因能夠降低N2a存活率，布比卡因濃度越大、作用時間越長，其神經(jīng)毒性作用越強，具有劑量和時間的雙

7、重依賴性。確定布比卡因誘導(dǎo)致N2a神經(jīng)細(xì)胞損傷的最適有效濃度和時間為900μmol/L培養(yǎng)12h。
　　(2) GM-1對布比卡因的神經(jīng)損傷具有顯著保護(hù)作用，其保護(hù)作用與劑量有關(guān)，本實驗的最大保護(hù)濃度為10gmol/L。光學(xué)顯微鏡下布比卡因組N2a細(xì)胞形態(tài)改變明顯、細(xì)胞存活率顯著下降、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞核固縮率明顯增加。上述指標(biāo)的結(jié)果均顯示A組和BG1、BG2、BG3、BG4、BG5組的細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞核固縮率明顯低于B組，差異有統(tǒng)

8、計學(xué)意義(P＜0.05），與A組比較，BG5組凋亡率和核固縮率無明顯差異(P＞0.05），A組細(xì)胞凋亡率和核固縮比率低于BG2、BG3、BG4各組(P＜0.05);BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各組間比較，凋亡率和核固縮率隨著GM-1濃度的增大而減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　(3)布比卡因產(chǎn)生的神經(jīng)毒性與線粒體途徑的細(xì)胞凋亡有關(guān)。GM-1預(yù)處理可以抑制布比卡因產(chǎn)生的神經(jīng)毒性。A組、B組和GM-1預(yù)處理保護(hù)組

9、(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5組)的細(xì)胞均有Caspase-3、caspase-9的mRNA和蛋白的表達(dá)，但各組細(xì)胞對應(yīng)的表達(dá)水平都存在差別;B組mRNA和蛋白表達(dá)量高于A組和BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05），與A組比較，BG5組表達(dá)量無明顯差異(P＞0.05）;A組mRNA和蛋白表達(dá)量低于低于BG2、BG3、BG4各組(P＜0.05);BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各組

10、間比較，表達(dá)量隨著GM-1濃度的增大而減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　A組、B組和GM-1預(yù)處理保護(hù)組(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各組)的caspase-8的表達(dá)量無明顯變化，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　結(jié)論：布比卡因?qū)2a神經(jīng)細(xì)胞具有損傷作用，呈劑量和時間雙重正性相關(guān)，GM-1對布比卡因的神經(jīng)損傷具有顯著保護(hù)作用，其作用主要是通過調(diào)控凋亡因子的表達(dá)，即凋亡因子Caspase-3