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文檔簡介
1、目的:
本實(shí)驗(yàn)研究模型均采用體外培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞,探討布比卡因(bupivacaine,bup)的神經(jīng)毒性以及單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)甘脂(gangliosides,GM-1)預(yù)處理后對布比卡因誘導(dǎo)的細(xì)胞神經(jīng)毒性時(shí)的保護(hù)作用及可能作用機(jī)制。為其應(yīng)用于神經(jīng)保護(hù)及今后臨床上藥物防治布比卡因引起的潛在神經(jīng)毒性提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),尋求更為有效的治療方法。
方法:
所有試驗(yàn)均采用小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤
2、細(xì)胞N2a細(xì)胞作為研究對象。
(一)實(shí)驗(yàn)分組:
(1)實(shí)驗(yàn)一:將細(xì)胞分為下述幾組:對照組(C組):N2a細(xì)胞不進(jìn)行任何干預(yù),布比卡因?yàn)?μmol/L;布比卡因組,N2a細(xì)胞與不同濃度布比卡因600、900、1200、1500、2000μmol/L(B1、B2、B3、B4、B5組)作用。
(2)實(shí)驗(yàn)二:將細(xì)胞分為下列幾組:對照組(A組):無布比卡因損傷及GM-1干預(yù);布比卡因組(B組):布比卡因有效損傷濃度和
3、24h前無GM-1保護(hù);不同濃度的GM-1預(yù)保護(hù)組(BG組):在布比卡因有效損傷濃度前24h預(yù)先在培養(yǎng)液中加入不同濃度GM-10.001、0.01、0.1、1、10μmol/L(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5組)。
?。ǘ?shí)驗(yàn)一:通過觀察不同濃度的布比卡因?qū)2a神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用,找到最適合損傷濃度建立細(xì)胞損傷模型。
(1)評價(jià)指標(biāo):細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡率。
(2)試驗(yàn)步驟:將N2a細(xì)胞分別與不同
4、濃度的布比卡因0、600、900、1200、1500、2000μmol/L(C、B1、B2、B3、B4、B5組)分別作用6h、12h、24h、36h。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;CCK-8法評價(jià)細(xì)胞存活率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
?。ㄈ?shí)驗(yàn)二:明確GM-1對布比卡因誘導(dǎo)N2a神經(jīng)細(xì)胞損傷的是否具有保護(hù)作用。闡述GM-1對布比卡因誘導(dǎo)N2a細(xì)胞損傷的可能保護(hù)機(jī)制。
(1)評價(jià)指標(biāo):細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞核固縮率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞凋
5、亡因子Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
(2)試驗(yàn)步驟:將N2a細(xì)胞用不同濃度0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5組)的GM-1預(yù)處理24h后均再加入布比卡因(900μmol/L)繼續(xù)作用12h,建立好細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)P?。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;采用CCK-8法評價(jià)N2a神經(jīng)細(xì)胞存活率;Hoechst33258熒光染色
6、法檢測細(xì)胞核固縮率;以流式細(xì)胞儀技術(shù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染方法檢測細(xì)胞凋亡率;以RT-PCR和Westernblot法測定不同濃度GM-1對損傷細(xì)胞神經(jīng)元caspase-3、csapase-8、caspase-9基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
結(jié)果:
(1) CCK-8法檢測結(jié)果表明,布比卡因能夠降低N2a存活率,布比卡因濃度越大、作用時(shí)間越長,其神經(jīng)毒性作用越強(qiáng),具有劑量和時(shí)間的雙
7、重依賴性。確定布比卡因誘導(dǎo)致N2a神經(jīng)細(xì)胞損傷的最適有效濃度和時(shí)間為900μmol/L培養(yǎng)12h。
(2) GM-1對布比卡因的神經(jīng)損傷具有顯著保護(hù)作用,其保護(hù)作用與劑量有關(guān),本實(shí)驗(yàn)的最大保護(hù)濃度為10gmol/L。光學(xué)顯微鏡下布比卡因組N2a細(xì)胞形態(tài)改變明顯、細(xì)胞存活率顯著下降、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞核固縮率明顯增加。上述指標(biāo)的結(jié)果均顯示A組和BG1、BG2、BG3、BG4、BG5組的細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞核固縮率明顯低于B組,差異有統(tǒng)
8、計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與A組比較,BG5組凋亡率和核固縮率無明顯差異(P>0.05),A組細(xì)胞凋亡率和核固縮比率低于BG2、BG3、BG4各組(P<0.05);BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各組間比較,凋亡率和核固縮率隨著GM-1濃度的增大而減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
(3)布比卡因產(chǎn)生的神經(jīng)毒性與線粒體途徑的細(xì)胞凋亡有關(guān)。GM-1預(yù)處理可以抑制布比卡因產(chǎn)生的神經(jīng)毒性。A組、B組和GM-1預(yù)處理保護(hù)組
9、(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5組)的細(xì)胞均有Caspase-3、caspase-9的mRNA和蛋白的表達(dá),但各組細(xì)胞對應(yīng)的表達(dá)水平都存在差別;B組mRNA和蛋白表達(dá)量高于A組和BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各組,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與A組比較,BG5組表達(dá)量無明顯差異(P>0.05);A組mRNA和蛋白表達(dá)量低于低于BG2、BG3、BG4各組(P<0.05);BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各組
10、間比較,表達(dá)量隨著GM-1濃度的增大而減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
A組、B組和GM-1預(yù)處理保護(hù)組(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各組)的caspase-8的表達(dá)量無明顯變化,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:布比卡因?qū)2a神經(jīng)細(xì)胞具有損傷作用,呈劑量和時(shí)間雙重正性相關(guān),GM-1對布比卡因的神經(jīng)損傷具有顯著保護(hù)作用,其作用主要是通過調(diào)控凋亡因子的表達(dá),即凋亡因子Caspase-3
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