單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂體外定向誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:分離并培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，鑒定細(xì)胞表型，在體外用單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞并探索其最佳誘導(dǎo)濃度。
　　方法:獲取新生兒臍帶，剔除臍動(dòng)、靜脈，將間質(zhì)組織剪成微小組織塊，用膠原酶消化后將臍帶組織置于含有胎牛血清、營(yíng)養(yǎng)因子、青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原代細(xì)胞12小時(shí)后全量換液，24小時(shí)后半量換液，之后每3天換液一次，每次換液時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，貼壁情況，

2、計(jì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度，并拍照記錄。當(dāng)觀察到培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞呈放射狀生長(zhǎng)，或排列成漩渦狀時(shí)，加入胎牛血清終止消化，用胰蛋白酶消化后，按照1∶2或1∶3的比例傳代，記為P1。依次類(lèi)推，記為P2，P3。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　取培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3，P5，P10代細(xì)胞作細(xì)胞，用胰酶消化，用PBS緩沖液漂洗后重懸為單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，以大于105個(gè)的量平均分裝于10個(gè)EP管中，滴加單克隆抗體CD73、CD90和CD105、

3、CD19、CD34、CD45、CD11b和組織相容性抗原HLA-DR(MHC-Ⅱ)，用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC單克隆抗體作為同型對(duì)照。
　　擴(kuò)增后，取第3代細(xì)胞，分為A、B、C、D、E5組，前4組為實(shí)驗(yàn)組，E組為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組各組GM1濃度分別為:A組50μg/mL、B組100μg/mL、C組150μg/mL、D組200μg/mL，誘導(dǎo)液用L-DMEM培養(yǎng)基配制，對(duì)照組只含L-DMEM培養(yǎng)基。觀察5組誘導(dǎo)液誘導(dǎo)hUM

4、SCs的神經(jīng)分化的作用，每間隔1h觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)變化，于第6h用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物微管結(jié)合蛋白-2(MAP-2)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)情況，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比率，結(jié)果以(X)±s表示。
　　結(jié)果:可以從臍帶中分離并培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)的細(xì)胞在12h內(nèi)大部分細(xì)胞能貼壁，細(xì)胞呈菱形、多邊形，之后逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形細(xì)胞快速生長(zhǎng)，并能穩(wěn)定的傳代，至第10代仍能保持旺盛的增

5、殖能力。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)細(xì)胞呈放射狀、旋渦狀生長(zhǎng)，并可見(jiàn)細(xì)胞因生長(zhǎng)密度過(guò)大造成脫落。
　　用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞表型鑒定顯示P3、P5和P10代細(xì)胞均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD73、CD90和CD105，而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　誘導(dǎo)后1h，實(shí)驗(yàn)組各組均可見(jiàn)部分細(xì)胞胞體收縮為橢圓狀，兩端伸出突起，呈紡錘樣，以D組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)

6、量最多，A組最少;第2、3h各組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，突起伸長(zhǎng)，以D組比率最高;第4h時(shí)，A、B、C組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增加，表現(xiàn)為雙極或多極細(xì)胞，以雙極細(xì)胞為主，D組神經(jīng)樣細(xì)胞開(kāi)始脫落，比率不再增加;第5h時(shí)，A、B組神經(jīng)樣細(xì)胞增加不明顯，可見(jiàn)部分細(xì)胞脫落，C組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)目最多，也伴隨少量細(xì)胞脫落，D組神經(jīng)樣細(xì)胞呈片狀脫落，比率明顯下降;第6h時(shí)，A、B組神經(jīng)樣細(xì)胞不再增加，C組神經(jīng)樣細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化，D組視野內(nèi)僅見(jiàn)少量未脫落的神經(jīng)

7、樣細(xì)胞;E組誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化。
　　誘導(dǎo)至第6小時(shí)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示實(shí)驗(yàn)組各組神經(jīng)樣細(xì)胞成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物微管結(jié)合蛋白-2(MAP-2)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)呈陽(yáng)性表達(dá)，而膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)陰性，150μg/mL組細(xì)胞的MAP-2、NF-H陽(yáng)性表達(dá)率最高。對(duì)照組誘導(dǎo)前后無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以從臍帶組織中分離出來(lái)并可以穩(wěn)定的傳代，并表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，