單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂體外定向誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)樣細胞及其機制的研究.pdf

1、目的:分離并培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，鑒定細胞表型，在體外用單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)樣細胞并探索其最佳誘導(dǎo)濃度。
　　方法:獲取新生兒臍帶，剔除臍動、靜脈，將間質(zhì)組織剪成微小組織塊，用膠原酶消化后將臍帶組織置于含有胎牛血清、營養(yǎng)因子、青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原代細胞12小時后全量換液，24小時后半量換液，之后每3天換液一次，每次換液時用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，貼壁情況，

2、計數(shù)細胞生長密度，并拍照記錄。當(dāng)觀察到培養(yǎng)瓶中的細胞呈放射狀生長，或排列成漩渦狀時，加入胎牛血清終止消化，用胰蛋白酶消化后，按照1∶2或1∶3的比例傳代，記為P1。依次類推，記為P2，P3。繪制細胞生長曲線。
　　取培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的P3，P5，P10代細胞作細胞，用胰酶消化，用PBS緩沖液漂洗后重懸為單細胞懸浮液，細胞計數(shù)板計數(shù)細胞密度，以大于105個的量平均分裝于10個EP管中，滴加單克隆抗體CD73、CD90和CD105、

3、CD19、CD34、CD45、CD11b和組織相容性抗原HLA-DR(MHC-Ⅱ)，用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC單克隆抗體作為同型對照。
　　擴增后，取第3代細胞，分為A、B、C、D、E5組，前4組為實驗組，E組為對照組，實驗組各組GM1濃度分別為:A組50μg/mL、B組100μg/mL、C組150μg/mL、D組200μg/mL，誘導(dǎo)液用L-DMEM培養(yǎng)基配制，對照組只含L-DMEM培養(yǎng)基。觀察5組誘導(dǎo)液誘導(dǎo)hUM

4、SCs的神經(jīng)分化的作用，每間隔1h觀察誘導(dǎo)后細胞的形態(tài)變化，于第6h用免疫細胞化學(xué)染色方法檢測神經(jīng)元特異性標(biāo)記物微管結(jié)合蛋白-2(MAP-2)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達情況，并計算陽性細胞比率，結(jié)果以(X)±s表示。
　　結(jié)果:可以從臍帶中分離并培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，原代培養(yǎng)的細胞在12h內(nèi)大部分細胞能貼壁，細胞呈菱形、多邊形，之后逐漸變?yōu)殚L梭形細胞快速生長，并能穩(wěn)定的傳代，至第10代仍能保持旺盛的增

5、殖能力。當(dāng)細胞培養(yǎng)至第7天時細胞呈放射狀、旋渦狀生長，并可見細胞因生長密度過大造成脫落。
　　用流式細胞技術(shù)進行的細胞表型鑒定顯示P3、P5和P10代細胞均表達間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)記物CD73、CD90和CD105，而不表達造血干細胞標(biāo)記物CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，證明所培養(yǎng)的細胞為間充質(zhì)干細胞。
　　誘導(dǎo)后1h，實驗組各組均可見部分細胞胞體收縮為橢圓狀，兩端伸出突起，呈紡錘樣，以D組神經(jīng)樣細胞數(shù)

6、量最多，A組最少;第2、3h各組神經(jīng)樣細胞數(shù)量逐漸增加，突起伸長，以D組比率最高;第4h時，A、B、C組神經(jīng)樣細胞數(shù)繼續(xù)增加，表現(xiàn)為雙極或多極細胞，以雙極細胞為主，D組神經(jīng)樣細胞開始脫落，比率不再增加;第5h時，A、B組神經(jīng)樣細胞增加不明顯，可見部分細胞脫落，C組神經(jīng)樣細胞數(shù)目最多，也伴隨少量細胞脫落，D組神經(jīng)樣細胞呈片狀脫落，比率明顯下降;第6h時，A、B組神經(jīng)樣細胞不再增加，C組神經(jīng)樣細胞未見明顯變化，D組視野內(nèi)僅見少量未脫落的神經(jīng)

7、樣細胞;E組誘導(dǎo)前后細胞形態(tài)未見明顯變化。
　　誘導(dǎo)至第6小時，免疫細胞化學(xué)染色顯示實驗組各組神經(jīng)樣細胞成熟神經(jīng)細胞標(biāo)記物微管結(jié)合蛋白-2(MAP-2)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)呈陽性表達，而膠質(zhì)細胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達陰性，150μg/mL組細胞的MAP-2、NF-H陽性表達率最高。對照組誘導(dǎo)前后無明顯變化。
　　結(jié)論:人臍帶間充質(zhì)干細胞可以從臍帶組織中分離出來并可以穩(wěn)定的傳代，并表達間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志，