傷害性感受器NK-1受體的激活增強(qiáng)TRPV1和TTX不敏感鈉通道活動(dòng)的機(jī)制研究.pdf

1、背根節(jié)介導(dǎo)傷害性信息的初級(jí)感覺神經(jīng)元的外周終末，稱為“傷害性感受器”或“痛覺感受器”。傷害性感受器將傷害性刺激換能，轉(zhuǎn)變成神經(jīng)沖動(dòng)，傳遞到脊髓背角，經(jīng)初步整合傳遞到大腦進(jìn)行信息加工，最終產(chǎn)生痛覺。背根節(jié)中的傷害性感覺神經(jīng)元作為痛覺傳導(dǎo)的第一級(jí)神經(jīng)元，在痛覺產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要的作用。 P物質(zhì)(SP)是速激肽家族的主要成員，在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，主要存在傷害性感覺神經(jīng)元上，是外周傷害性傳入信息向脊髓背角神經(jīng)元傳遞的

2、主要信使之一。SP在背根節(jié)神經(jīng)元胞體合成，雙向地輸送到傷害性感覺神經(jīng)元的中樞末梢和外周末梢，包含在大的致密的囊泡中。在中樞端的脊髓背角，SP陽性的神經(jīng)末梢與背角Ⅰ層的投射神經(jīng)元連接，傳遞傷害性信息；而在外周神經(jīng)末梢，傷害性感受器的SP作為炎癥因子之一，釋放到外周，激活肥大細(xì)胞，產(chǎn)生外周敏化機(jī)制。速激肽家族有三種受體：NK-1、NK-2和NK-3，其中SP對(duì)NK-1的親和力最高，因此，NK-1被公認(rèn)為SP受體。 SP作為脊髓傷害性

3、初級(jí)傳入信使，在行為、細(xì)胞和分子水平已進(jìn)行了深入的研究。如外周傷害性刺激引起SP在脊髓背角淺層釋放；脊髓施加NK-1激動(dòng)劑和拮抗劑，可分別增強(qiáng)和抑制脊髓背角痛敏神經(jīng)元活動(dòng)、傷害性反射和Fos表達(dá)；NK-1或者SP基因敲除的動(dòng)物，急性痛不受影響，但是慢性痛的形成過程大大減慢。但是關(guān)于SP參與外周敏化的機(jī)制以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路卻知之甚少。本實(shí)驗(yàn)室以前的工作表明，含有SP的背根節(jié)神經(jīng)元可能表達(dá)NK-1自身受體；SP引起外周的熱痛覺過敏，而這一過

4、程與表達(dá)NK-1的肥大細(xì)胞沒有關(guān)系。本論文應(yīng)用免疫組織化學(xué)、蛋白免疫印跡、全細(xì)胞膜片鉗以及鈣成像等多種技術(shù)，對(duì)NK-1自身受體的存在、NK-1對(duì)介導(dǎo)熱痛敏的辣椒素受體TRPV1和TTX不敏感鈉通道的調(diào)制，以及可能的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。 一.形態(tài)學(xué)觀察 背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上存在NK-1受體。該受體合成后被運(yùn)輸?shù)酵庵苌窠?jīng)末梢，在完全福氏佐劑致炎2天之后，表達(dá)量明顯升高。同時(shí)在DRG小細(xì)胞上存在一定比例NK-1與SP雙標(biāo)神經(jīng)元和N

5、K-1與TRPV1雙標(biāo)的神經(jīng)元。 二.SP對(duì)TRPV1的調(diào)制 1.SP增強(qiáng)TRPV1活動(dòng) TRPV1受體是一個(gè)非選擇性的陽離子通道，在全細(xì)胞膜片鉗和鈣成像試驗(yàn)中，TRPV1受體特異的激動(dòng)劑辣椒素分別引起細(xì)胞的內(nèi)向電流以及胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬時(shí)升高，而SP均能夠引起TRPV1反應(yīng)的增強(qiáng)。75.8％的背根神經(jīng)節(jié)小細(xì)胞(直徑＜25μM)對(duì)辣椒素有反應(yīng)。其中在49.6％的辣椒素反應(yīng)陽性神經(jīng)元中，SP對(duì)辣椒素反應(yīng)有增強(qiáng)作用(

6、409.12±44.54％)。NK-1受體的激動(dòng)劑[Sar9，Met(O2)11]SP(Sar-SP，1μM)能夠模擬SP的作用；NK-1特異性的拮抗劑GR82，334(1μM)和WIN58，078(5μM)能夠特異性的抑制SP引起的反應(yīng)，而NK-2和NK-3的拮抗劑L659，187(1μM)和SR-142，801(1μM)不影響SP引起的增強(qiáng)作用，提示SP特異的通過NK-1受體調(diào)節(jié)TRPV1受體的功能。 2.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制分析

7、 G蛋白特異拮抗劑GDP-β-s(1 mM，胞內(nèi))、PKC的抑制劑BIM(1μM)和CheL.C(1μM)以及PKCε亞型的特異拮抗劑εV1-2(200μM，胞內(nèi))也特異性的抑制SP引起的反應(yīng)，PKC的激活劑PMA(0.6μM)能夠模擬SP引起辣椒素反應(yīng)的增大；PKA的拮抗劑H89(1μM)以及細(xì)胞內(nèi)鈣的螯合劑BEPTA不能抑制SP引起的辣椒素反應(yīng)的增強(qiáng)。以上結(jié)果提示SP在外周神經(jīng)末梢激活G蛋白偶聯(lián)的NK-1受體，激活PKC的亞型

8、PKCε，從而磷酸化TRPV1受體，產(chǎn)生熱痛覺過敏的作用。 三.SP調(diào)制TTX不敏感鈉通道 TTX不敏感的鈉通道包含兩種亞型Nav1.8和Nav1.9，兩者根據(jù)電流性質(zhì)的不同，分別參與動(dòng)作電位的產(chǎn)生和靜息膜電位的維持。我們采用全細(xì)胞膜片鉗的方法，使用不同的電壓刺激方法，成功分離了兩種亞型鈉離子通道的電流。 1.Nav1.8 在78.3％(22/28)的背根神經(jīng)節(jié)小細(xì)胞上能夠記錄到Nav1.8介導(dǎo)的高閾值激

9、活的鈉電流，其中在40.9％(9/22)的Nav1.8陽性反應(yīng)細(xì)胞中，特異性NK-1的激動(dòng)劑Sar-SP(1μM)顯著性的增強(qiáng)Nav1.8亞型鈉通道介導(dǎo)的電流(123.52±2.83％)；且Sar-SP使Nav1.8亞型鈉通道的激活和穩(wěn)態(tài)失活曲線向超極化方向移動(dòng)。 2.Nav1.9 在62.6％(20/32)背根神經(jīng)節(jié)小細(xì)胞上能夠記錄到低閾值激活的不失活的Nav1.9介導(dǎo)的鈉電流，在35％(7/20)的Nav1.9陽性反

10、應(yīng)細(xì)胞上，Sar-SP顯著性的增強(qiáng)Nay1.9亞型鈉通道介導(dǎo)的電流(110.27±2.33％)。提示SP通過增強(qiáng)兩種亞型鈉離子通道的敏感性提高傷害性感受器的興奮性。 綜上所述，本論文首次系統(tǒng)的論述了SP通過激活傷害性感受器上的NK-1自身受體，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，增強(qiáng)傷害性感受器上TRPV1受體和TTX不敏感鈉通道的敏感性，從而產(chǎn)生外周敏化的機(jī)制。這項(xiàng)研究不僅揭示了新的外周敏化的機(jī)制，也為我們進(jìn)一步了解炎癥過程中的痛覺過敏的產(chǎn)