激活TRPV1促進腎臟鈉排泄及降低血壓的機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　高血壓是當前我國乃至世界范圍內最為常見的疾病之一，其患病率呈持續(xù)增長趨勢。高血壓是冠心病、腦卒中、心力衰竭、腎功能衰竭等疾病的主要危險因素，也是致殘和死亡的重要原因，其防治具有重要的現實意義。作為高血壓發(fā)病的主要環(huán)境因素之一，高鹽攝入在其中起到了關鍵性作用。目前我國在高血壓的人群防治方面已經積極倡導限鹽，但因人群依從性差而難以長期堅持和推廣。研究證實，腎臟正常的尿鈉排泄功能具有穩(wěn)定血容量及維持血壓平穩(wěn)的作用。對高

2、血壓病人可給予利尿劑進行治療，但長期應用有致水、電解質紊亂等副作用。因此，深入研究高鹽飲食狀態(tài)下腎臟鈉重吸收的調節(jié)機制，探索新的干預靶點和經濟易行的干預措施，對我國高血壓的防控具有重要意義。
　　體內總鈉量決定著細胞外液量及血容量，是血壓的重要決定因素。正常成人每日產生的原尿達180L，其中99％以上的水鈉在腎小管和集合管中被重吸收。約10％的鈉在遠端腎單位（遠曲小管和集合管）被重吸收，此處是多種激素、信號分子作用的靶點，其功能變

3、化可導致嚴重血壓異常。在末段遠曲小管和集合管有阿米洛利敏感的上皮細胞鈉通道(ENaC)，是對尿鈉進行最后精細調控的部位。ENaC可受賴氨酸缺陷型蛋白激酶(WNK)家族的調控，在給予高鹽飲食后，與WT相比，WNK1-/-小鼠腎小管上皮ENaC功能明顯減弱。
　　瞬時受體電位通道香草醛亞族1(TRPV1)是一種非選擇性陽離子通道，它最先發(fā)現于神經細胞，可以被辣椒素所激活。近來研究顯示，TRPV1不僅存在于神經細胞，在腎小管上皮細胞中也

4、有表達，并參與腎臟對水鈉平衡的調控。而對于高鹽飲食者進行長期的辣椒素干預對其腎臟排鈉及血壓的影響目前還不清楚。因此，本研究以C57BL/6野生型小鼠(WT)和TRPV1基因敲除小鼠(TRPV1-/-)為研究對象，分別從整體動物及細胞水平的角度，首先證實小鼠腎臟皮質集合管(CCD)及體外培養(yǎng)的M1-CCD細胞存在功能性TRPV1的表達，并參與介導膳食辣椒素引起的尿鈉排泄增多;進而明確長期膳食辣椒素干預通過激活小鼠腎臟皮質集合管TRPV1，

5、降低高鹽飲食引起的血壓增高;并進一步探討膳食辣椒素促進尿鈉排泄的分子機制并揭示TRPV1在其中的作用。
　　材料與方法:
　　整個研究分為離體實驗和在體實驗。離體實驗以小鼠腎皮質集合管（M1-CCD）細胞為研究對象;在體實驗以TRPV1基因敲除(TRPV1-/-)小鼠（美國Jackson實驗室）及C57BL/6J（野生型，WT）小鼠為研究對象，TRPV1-/-小鼠和WT小鼠隨機分為高鹽組(HS)、普食組(ND)、高鹽加辣椒素

6、組(HSC)予以飲食干預10月。
　　1.無線遙測血壓技術監(jiān)測動物的24小時動態(tài)收縮壓及舒張壓。鼠尾血壓儀每兩月檢測小鼠鼠尾血壓。
　　2.代謝籠收集小鼠24小時尿液，檢測24小時進水量及尿量，利用電解質分析儀檢測尿鈉、鉀、氯等電解質濃度，并計算24小時尿鈉排泄量。
　　3.熒光標記法檢測M1-CCD細胞予以不同濃度NaC1溶液干預后細胞內游離鈣及游離鈉的濃度變化。
　　4.蛋白免疫印跡法檢測小鼠長期飲食干預后腎

7、皮質集合管WNK1、WNK4、SGK1、αENaC、βENaC等關鍵酶及特定離子通道的表達變化。
　　5.免疫沉淀法檢測腎皮質集合管細胞αENaC和TRPV1的相互作用。
　　6.免疫熒光染色法觀察TRPV1和αENaC在M1-CCD細胞及WT小鼠腎皮質集合管上的表達情況。
　　結果:
　　1.TRPV1和αENaC在M1-CCD細胞及WT小鼠腎皮質集合管上存在共表達，辣椒素升高胞漿中游離鈣濃度([Ca2+]i)

8、并且呈劑量依賴性。WT小鼠高鹽辣組的24小時尿鈉排泄量比高鹽組顯著增高，而TRPV1-/-小鼠高鹽辣組則沒有這種作用。WT和TRPV1-/-小鼠高鹽組和高鹽辣組的24小時尿量均無明顯差異。
　　2.飲食干預10個月后，WT小鼠高鹽辣組24小時動脈收縮壓、舒張壓均顯著低于高鹽組。WT和TRPV1-/-小鼠高鹽組和高鹽辣組的血漿醛固酮水平均顯著低于普食組。WT和TRPV1-/-小鼠高鹽組和高鹽辣組的24小時尿氯排泄量及進水量均顯著高于

9、普食組。
　　3.腹腔注射阿米洛利后，WT和TRPV1-/-小鼠高鹽組和高鹽辣組24小時尿鈉排泄量的增加較普食組均顯著增加;WT小鼠高鹽辣組24小時尿鈉排泄量的增加則明顯低于高鹽組。WT和TRPV1-/-小鼠高鹽、高鹽辣組腎皮質集合管αENaC、βENaC及WNK1、SGK1的蛋白表達較普食組明顯增加，WT小鼠高鹽辣組腎皮質集合管αENaC、WNK1和SGK1的表達較高鹽組明顯降低，而TRPV1-/-小鼠則沒有變化。
　　4

10、.高鹽溶液能夠降低M1-CCD細胞TRPV1的表達，同時增加αENaC的表達;而辣椒素能夠上調M1-CCD細胞TRPV1的表達，并降低αENaC的表達，TRPV1特異性阻斷劑iRTX則能夠抑制辣椒素的這種作用。WT小鼠的腎皮質集合管中αENaC可與TRPV1產生特異性相互作用。TRPV1特異性抑制劑iRTX能夠明顯減弱辣椒素對M1-CCD細胞胞漿鈉攝取的拮抗作用。
　　結論:
　　1.WT小鼠腎皮質集合管及M1-CCD細胞上