P物質(zhì)及其NK-1受體參與大鼠外周傷害性信息傳入引起的脊髓后角小膠質(zhì)細胞的激活.pdf

1、目的:近年來，隨著對中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞功能研究的深入，其在外周神經(jīng)損傷及炎癥誘發(fā)的病理性痛中的作用越來越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，在外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性痛模型中或福爾馬林、角叉菜膠等引起的炎性痛模型中，均伴有脊髓后角小膠質(zhì)細胞的激活。活化激活的小膠質(zhì)細胞通過產(chǎn)生和釋放多種促炎細胞因子如白介素-1β，腫瘤壞死因子-α等，上調(diào)表達多種活性蛋白或受體，如補體受體CD4、C3、CX3CR1，ATP受體P2X(4)等，直接或間接作用于痛覺傳

2、遞神經(jīng)元，使其敏化，參與病理性痛及痛覺過敏的產(chǎn)生與維持。而給予小膠質(zhì)細胞抑制劑米諾環(huán)素抑制小膠質(zhì)細胞的激活后，可顯著抑制病理性痛及痛覺過敏的產(chǎn)生。以上研究表明，小膠質(zhì)細胞的激活在病理性痛及痛覺過敏的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用。但在這一過程中，小膠質(zhì)細胞激活的具體機制尚不完全清楚。
　　P物質(zhì)(Substance P，SP)是脊髓內(nèi)重要的神經(jīng)激肽類遞質(zhì)，被認為是痛覺傳遞的重要信使。傳統(tǒng)觀念認為，SP主要存在于脊髓Ⅱ板層初級傳入纖維（C

3、類纖維）末梢中。它的受體神經(jīng)激肽-1(neurokinin-1，NK-1)受體主要分布在脊髓后角Ⅰ板層神經(jīng)元的樹突和胞體上。SP通過與其NK-1受體結(jié)合發(fā)揮作用，參與脊髓傷害性信息的傳遞。但是近年來的研究發(fā)現(xiàn)，除了初級傳入末梢外，人胚和鼠類的小膠質(zhì)細胞也可以釋放大量的SP。同時，除了介導痛覺傳遞的二級神經(jīng)元胞體外，人胚和鼠類的小膠質(zhì)細胞上也表達著有功能的NK-1受體。因此，傷害性信息傳入時，引起SP釋放也可能通過膠質(zhì)細胞膜上的NK-1受

4、體參與脊髓小膠質(zhì)細胞的激活。
　　因此，本實驗通過觀察應(yīng)用NK-1受體拮抗劑L-732，138對大鼠蜜蜂毒(bee venom，BV)炎性痛及痛過敏時脊髓后角小膠質(zhì)細胞CD11b/c(OX-42)表達的影響，探討SP及其NK-1受體在外周傷害性信息傳入引起的脊髓后角小膠質(zhì)細胞激活中的作用。
　　方法:雄性Sprague-Dawley大鼠84只，體重250-280 g，隨機分為以下5組:
　?、賁ham組(n=24):于

5、正常大鼠右后足底皮下注射生理鹽水50μl。
　?、诿鄯涠窘M(n=24):于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液(4g/L)50μl。
　?、勖鄯涠?L-732，138組(n=12):給大鼠椎管內(nèi)注射10μl NK-1受體拮抗劑L-732，138(200 nmol)，15min后于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液(4g/L)50μl。
　?、苊鄯涠?DMSO組(n=12):給大鼠椎管內(nèi)注射10μl80％DMSO（L-732，13

6、8的溶劑），15 min后于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液(4g/L)50μl。
　?、軸ham+L-732，138組(n=12):給大鼠椎管內(nèi)注射10μl NK-1受體拮抗劑L-732，138（200 nmol），15 min后于大鼠右后足底皮下注射50μl生理鹽水。
　　各組大鼠于足底注射生理鹽水或蜜蜂毒溶液后即刻計數(shù)1h內(nèi)自發(fā)縮足次數(shù)，觀察其自發(fā)痛反應(yīng)變化;并于足底注射前1d、注射后1d、3d、7d測定熱縮足反射潛伏期

7、及機械縮足反射閾值的變化;Sham組與蜜蜂毒組于足底注射后1h、1d、3d、7d取材，其余各組于足底注射后3d取材，冰凍連續(xù)切片，應(yīng)用免疫組化法觀察L5節(jié)段脊髓后角CD11b/c(OX-42)蛋白的表達，以觀察脊髓后角小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1 NK-1受體拮抗劑L-732，138減輕足底注射蜜蜂毒大鼠的自發(fā)痛及痛過敏反應(yīng)
　　1.1自發(fā)痛行為反應(yīng)
　　足底注射生理鹽水后，大鼠不產(chǎn)生自發(fā)痛行為，而

8、足底注射蜜蜂毒后，大鼠出現(xiàn)明顯的自發(fā)痛行為，表現(xiàn)為緊張性的舔，咬和劇烈抖動注射足，注射足抬高，不持重或持重減輕等行為，自發(fā)痛反應(yīng)評分顯著增加(P＜0.05)。與蜜蜂毒組相比，椎管內(nèi)預先注射L-732，138后，大鼠的自發(fā)痛行為反應(yīng)有所減輕，自發(fā)痛反應(yīng)評分顯著降低（P＜0.05）;而椎管內(nèi)預先注射DMSO對注射蜜蜂毒引起的自發(fā)痛行為無顯著影響。椎管內(nèi)注射L-732，138不會引起sham組大鼠的自發(fā)痛行為。
　　1.2熱縮足反射潛伏

9、期和機械縮足反射閾值
　　與注射前相比，足底注射生理鹽水（sham組）后1d、3d和7d，大鼠注射足的熱縮足反射潛伏期和機械縮足反射閾值無顯著變化。足底注射蜜蜂毒后，上述各時間點大鼠注射足的熱縮足反射潛伏期和機械縮足反射閾值均較sham顯著降低(P＜0.05)，其中以注射后1d降低最為顯著，3d、7d逐漸回升，表明足底注射蜜蜂毒誘發(fā)大鼠產(chǎn)生了熱和機械性痛覺過敏。椎管內(nèi)預先注射L-732，138可顯著抑制注射蜜蜂毒大鼠熱縮足反射潛伏

10、期和機械縮足反射閾值的下降(P＜0.05);而椎管內(nèi)預先注射DMSO對注射蜜蜂毒大鼠的熱縮足反射潛伏期和機械縮足反射閾值無顯著影響。椎管內(nèi)注射L-732，138對sham組大鼠的熱縮足反射潛伏期和機械縮足反射閾值無顯著影響。
　　2 NK-1受體拮抗劑L-732，138抑制蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細胞的激活
　　免疫組化染色結(jié)果顯示，CD11b/c(OX-42)在sham組大鼠L5節(jié)段脊髓后角有一定量的基礎(chǔ)表達，免疫反

11、應(yīng)陽性細胞較少，胞體較小，突起較細，散在分部于脊髓后角。大鼠足底注射蜜蜂毒1h后，脊髓后角免疫反應(yīng)陽性細胞未見明顯變化;注射后1d時，免疫陽性細胞數(shù)量顯著增多，胞體增大，突起變粗，免疫染色積分光密度值顯著增大（P＜0.05）;注射后3d時，CD11b/c(OX-42)表達達到高峰;注射后7d時，雖然CD11b/c（OX-42）陽性表達水平仍較高，但較3d時有所減少。以上結(jié)果表明，脊髓后角小膠質(zhì)細胞在蜜蜂毒炎性痛模型中受到炎性刺激后1d開

12、始激活，3d時激活達到高峰，7d時開始減弱。
　　在上述實驗的基礎(chǔ)上，選擇小膠質(zhì)細胞激活最明顯的3d時間點，觀察NK-1受體拮抗劑L-732，138對蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細胞激活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預先椎管內(nèi)給予NK-1受體拮抗劑L-732，138后，可顯著抑制蜜蜂毒引起的大鼠脊髓后角CD11b/c(OX-42)表達的上調(diào)，表現(xiàn)為免疫陽性細胞數(shù)量減少，胞體縮小，突起變細，免疫染色積分光密度值顯著降低(P＜0.05)。表明N

13、K-1受體拮抗劑L-732，138抑制了蜜蜂毒引起的大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細胞的激活。
　　結(jié)論:
　　1、大鼠足底注射蜜蜂毒可引起大鼠自發(fā)痛反應(yīng)及熱和機械性痛覺過敏，同時引起大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細胞的激活。
　　2、NK-1受體拮抗劑L-732，138可顯著抑制蜜蜂毒引起的大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細胞的激活，同時可減輕蜜蜂毒引起的大鼠自發(fā)痛反應(yīng)及熱和機械性痛覺過敏。
　　3、上述結(jié)果提示，SP及其NK-1受體參與傷害性信息