傷害性初級傳入的突觸前及突觸后NMDA受體介導慢性痛敏化的分子機制研究.pdf

1、近年來,慢性痛的機制研究取得了長足的進展,大量的受體、通道、激酶系統(tǒng)在慢性痛的發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸被揭示。炎癥或損傷后感覺神經元第一級突觸的谷氨酸能突觸的功能性變化在慢性痛的發(fā)展和維持中起關鍵作用。在慢性疼痛中樞敏化的過程中,NMDA受體同樣發(fā)揮著重要的作用。免疫組織化學研究顯示NMDA受體廣泛表達于中樞神經系統(tǒng)突觸后神經元上,同時大量的研究表明,NMDA受體也同時表達在突觸前終末以及背根節(jié)(dorsal root ganglion,

2、DRG)神經元上。DRG位于外周神經系統(tǒng),位于其內的中、小型神經元,包括其胞體及中樞突和外周突的A和C纖維,主要負責感受和傳遞痛覺信息,因此又被稱為痛感受器或傷害性感受器(nociceptor)。由于這些受體可被痛感受器自身釋放的谷氨酸所激活,所以又被稱為痛感受器的自身受體或自受體(autoreceptor)。脊髓背角突觸前終末釋放谷氨酸可被多種因素影響,其中激活I類促代謝型谷氨酸受體、P2X3受體會導致突觸前末梢釋放谷氨酸增加,而激活

3、μ-阿片受體、α2腎上腺素能受體、CB1大麻素受體、GABAB受體以及II類和III類促代謝型谷氨酸受體都可以導致突觸前谷氨酸釋放的降低。谷氨酸能突觸的功能主要能被三個因素影響:
　?、偻挥|前谷氨酸能神經元釋放的谷氨酸量;
　?、谶M入突觸間隙中谷氨酸轉運體攝取谷氨酸的比率;
　　③突觸后膜上功能性谷氨酸受體的數量。
　　在其他神經系統(tǒng)的研究表明,突觸前NMDA受體可以調節(jié)海馬、小腦等部位的突觸遞質釋放。Bardo

4、niet等在正常動物的脊髓薄片標本上的研究表明,激活外周傳入末梢的突觸前NMDA受體,可以抑制脊髓背角eEPSC的幅值,延長eEPSC的潛伏期;進一步表明突觸前NMDA受體的激活可以抑制脊髓背角Lamina II神經元的突觸傳遞,這一結果提示突觸前的NMDA自身受體可能對痛覺信息的傳入產生負反饋調節(jié)作用。因此,突觸前末梢釋放的谷氨酸可直接作用于突觸前的NMDA受體,產生復雜多樣的作用。傳統(tǒng)觀念認為其最主要功能是作為負反饋抑制突觸前遞質的

5、釋放,從而防止突觸間隙的遞質濃度過高。
　　前期研究表明,激活嗎啡耐受大鼠的突觸前NMDA受體可以增強突觸前末梢谷氨酸的釋放。在癲癇動物模型上,激活前腦突觸前NMDA受體也可以導致突觸前末梢谷氨酸的釋放增加。免疫組織化學和免疫印跡實驗結果發(fā)現在損傷或炎癥誘發(fā)的慢性痛狀態(tài)下,痛感受器NMDA自身受體的表達水平明顯升高。功能學研究結果顯示慢性痛狀態(tài)下痛感受器NMDA自身受體的功能活動呈現明顯增強,例如,實驗性結腸炎誘發(fā)痛感受器NMDA

6、自身受體的磷酸化水平顯著升高、NMDA誘發(fā)的內向電流幅度和細胞內鈣濃度明顯上升。這些研究結果均提示慢性痛狀態(tài)下,痛感受器NMDA自身受體的功能狀態(tài)顯著增強。鞘內注射NMDA激活突觸前NMDA受體可以導致外周終末釋放P物質。Yan等發(fā)現,在外周損傷的情況下,突觸前NMDA受體活動的增強則可以提高突觸前谷氨酸的釋放。在病理狀態(tài)下,已有的行為學研究顯示,局部注入NMDA受體拮抗劑對炎癥或損傷誘致的痛過敏和神經元放電增強具有顯著的抑制作用而非增

7、強作用。這些結果提示在炎癥或損傷的情況下,突觸前NMDA受體可能發(fā)生了活動依賴性改變,即在脊髓淺層由生理狀態(tài)轉為炎癥病理狀態(tài)時,突觸前NMDA受體對突觸傳遞的抑制效應轉變成興奮效應。盡管上述結果提示外周部位的NMDA受體可能在病理狀態(tài)下具有致痛敏作用,但這些結果均來自于外周局部注入NMDA受體拮抗劑,而這些拮抗劑的特異性、作用時程以及確切的作用靶點都難以確定,因此上述結果還不能確切揭示痛感受器NMDA自身受體在病理狀態(tài)下的具體作用及功能

8、。綜上所述,為了特異性地揭示痛感受器NMDA自身受體是否在慢性病理性痛中發(fā)揮著致痛敏作用,我們應用Cre-loxP技術在痛感受器上建立了條件性敲除NMDA自身受體的必需組分——功能亞單位NR1基因的轉基因動物模型,即特異性地剔除痛感受器NMDA自身受體的正常結構和功能,而保留中樞神經系統(tǒng)以及非神經系統(tǒng)的NMDA受體結構和功能完整。
　　本研究在痛感受器上建立了條件性敲除NMDA自身受體的轉基因動物模型,進一步研究突觸前NMDA受體

9、在生理狀態(tài)以及病理狀態(tài)下對傷害性感受神經元第一級突觸的作用,從而研究病理過程中的突觸前NMDA受體的活動依賴性改變,為進一步認識NMDA受體的作用和功能奠定基礎。
　　有研究表明脊髓背角淺層的突觸后神經元上的離子通道變化在慢性痛的中樞敏化過程中發(fā)揮重要作用。突觸后神經元內Ca2+濃度的動態(tài)變化可以編碼突觸前后神經元的動作電位時序,進而啟動引起突觸傳遞效率改變的胞內過程。一般認為,重復在EPSP之后刺激突觸后神經元產生動作電位可以高

10、度激活突觸后NMDA受體,產生大幅度的Ca2+內流,激活鈣離子/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶 II(CaMKII)而導致LTP的產生。因此,突觸后NMDA受體的功能性改變對中樞敏化的產生及發(fā)展起關鍵性作用。
　　CCL2又稱為單核細胞趨化因子-1(monocytes chemoattractant protein1,MCP-1),其可以招募單核細胞到達炎癥、感染、外傷、局部缺血等部位。大量實驗表明CCL2與疼痛密切相關。電生理實驗發(fā)現在

11、培養(yǎng)DRG神經元上充灌CCL2可以導致細胞內鈣離子濃度增加。同時表現出神經病理性痛行為的動物DRG神經元在給予CCL2后可發(fā)生顯著的去極化。CCL2導致的痛感受器敏化可能是由于其激活了 TRP通道以及抑制了K+電導。Yang等的研究表明,CCL2抑制了一種電壓依賴的不失活的外向流,推測可能是外向整流鉀電流。CCL2通過軸漿運輸從DRG輸送到外周神經終末,從而在皮內注射CCL2也可以直接導致機械痛敏反應的增強。同時大量的研究表明,外周神經

12、損傷后,CCL2可能作為一種神經調制,從外周神經到脊髓背角具有活動依賴性釋放的特征,即不同的病理條件可以通過調節(jié)CCL2的釋放,進而影響病理性過程。
　　也有研究表明,CCR2也表達在脊髓背角神經元胞體。但是神經元胞體上的CCR2結合了CCL2后如何發(fā)揮功能尚未見報道。我們的研究進一步發(fā)現,CCL2可以結合脊髓背角神經元上的CCR2,通過進一步激活細胞外信號相關蛋白激酶(extracellular signal regulated

13、 kinases,ERK)信號通路,從而導致脊髓背角突觸后神經元NMDA受體通道功能的上調,進而對慢性痛發(fā)揮進行調節(jié),而這種作用主要是通過NR2B亞單位介導的。炎癥條件下,花生四烯酸可以通過Cox酶解產生前列腺素(prostglandin,PG),其中前列腺素E2(PGE2)參與炎癥反應,并可以刺激外周神經末梢引起痛覺敏化,而Cox-2的表達在炎癥刺激下顯著升高。而抑制Cox-2即可以抑制PGE2。研究表明,在海馬PGE2可以作用于突觸

14、前EP2受體從而導致突觸前谷氨酸釋放的增加。大量研究表明,PGE2可以誘導CCL2/MCP-1的釋放。本研究結果表明,CCL2誘導的脊髓背角突觸后神經元NMDA電流增強的作用不能被Cox-2阻斷劑完全阻斷,因此CCL2可直接作用于神經元胞體,通過ERK調節(jié)NR2B從而導致中樞敏化。
　　第一部分、痛感受器NMDA自身受體的致痛敏作用及其機制
　　在慢性疼痛的中樞敏化過程中,NMDA受體發(fā)揮著重要的作用。大量結果提示外周部位的

15、NMDA受體可能在病理狀態(tài)下具有致痛敏作用,但是應用拮抗劑進行研究具有一定的局限性。目前的研究結果還不能確切揭示痛感受器NMDA自身受體在病理狀態(tài)下的具體作用及功能,因此我們擬用在痛感受器上條件性敲除NMDA自身受體的轉基因動物模型,進一步研究突觸前NMDA受體在生理狀態(tài)以及病理狀態(tài)下對傷害性感受神經元第一級突觸的作用,旨在研究病理過程中的突觸前NMDA受體的活動依賴性改變,為進一步認識NMDA受體的作用和功能奠定基礎。
　　結果

16、如下:
　　1.建立SNS-NR1-/-小鼠
　　我們應用Cre-loxP技術在痛感受器上建立了條件性敲除NR1亞單位的轉基因動物模型。電生理實驗中,灌流給予NMDA可在 NR1fl/fl小鼠中IB4-Fluor488陽性標記的傷害性DRG神經元上誘致一顯著的內向電流,并且對NMDA受體拮抗劑AP5敏感;而NMDA誘發(fā)的內向電流在SNS-NR1-/-小鼠中幾乎被完全阻斷,說明在DRG神經元上,傷害感受性神經元的NMDA受體功

17、能被完全敲除,而其他非傷害性感受神經元上的NMDA受體功能未受影響。
　　2.行為學表型
　　通過行為學研究發(fā)現,NR1fl/fl小鼠與 SNS-NR1-/-小鼠的正常機械性痛域和熱痛域沒有顯著性差異。在后肢足底皮下注射Capsaicin誘致的急性自發(fā)痛反應過程中,NR1fl/fl小鼠與SNS-NR1-/-小鼠在反應時間上也沒有顯著差異。Formalin誘致的第二相持續(xù)性自發(fā)痛反應程度在SNS-NR1-/-小鼠中顯著低于野生

18、型小鼠,而后肢足底注射CFA誘致的機械性痛域和熱痛域則明顯弱于野生型小鼠。
　　3.機制探討
　　在DRG上應用全細胞膜片鉗記錄神經元,用串刺激使神經元釋放谷氨酸,在串放電之后可以見到明顯的內向電流,并且這個內向電流可以被NMDA受體阻斷劑AP5所阻斷。說明DRG釋放的谷氨酸可以作用于周圍神經元或者自身NMDA受體并發(fā)揮功能。
　　NR1fl/fl小鼠與SNS-NR1-/-小鼠的IB4-Fluor488陽性標記的傷害性

19、DRG神經元靜息膜電位、基強度以及閾值都沒有顯著差異。在CFA足底注射24 h后,NR1fl/fl動物神經元的靜息膜電位、基強度以及閾值顯著降低,而SNS-NR1-/-動物的IB4-Fluor488陽性標記的傷害性DRG神經元的靜息膜電位、閾值顯著降低,但是基強度無變化。而在對照組中,NR1fl/fl小鼠及SNS-NR1-/-小鼠中DRG神經元的靜息膜電位、基強度以及閾值無顯著變化。
　　研究發(fā)現,在NR1fl/fl小鼠,IB4-

20、Fluor488陽性標記的傷害性DRG神經元在采用不同斜率的斜波注入電流引起的神經元放電的個數在 CFA注射24 h后顯著升高,而在SNS-NR1-/-小鼠IB4-Fluor488陽性標記的傷害性DRG神經元,CFA足底注射24 h后并無顯著變化。
　　通過電生理實驗給予背根2Hz低頻條件刺激,在 NR1fl/fl小鼠向PAG投射的脊髓背角I層神經元上可誘導長時程增強現象(LTP)。而在特異性敲除突觸前NMDA受體的SNS-NR1

21、-/-小鼠上,向PAG投射的脊髓背角I層神經元上的LTP被顯著抑制。
　　第二部分、CCL2對脊髓背角Lamina II突觸后神經元NMDA受體的直接作用
　　本文擬對脊髓背角Lamina II神經元NMDA受體進行檢測,觀察單核細胞趨化因子-1(MCP-1)對脊髓背角Lamina II神經元NMDA受體的作用，進一步闡釋炎性致痛敏過程中，激活小膠質細胞以及星形膠質細胞釋放的細胞因子、趨化因子不僅僅可以通過作用于小膠質細胞本

22、身增強突觸后神經元的反應性，也可以通過趨化因子直接作用于突觸后神經元胞體，從而通過直接調控突觸后胞體上NMDA受體的表達來調控神經元的反應特性，突觸后NMDA受體的活動依賴性改變可以進一步引起中樞敏化，造成炎性損傷。
　　結果如下:
　　1.CCL2誘致動物痛行為反應增強對11只8wC57BL/6動物進行行為學檢測發(fā)現CCL2可以誘導痛行為增強。給予C57BL/6小鼠單次鞘內注射100閃的CCL2可以誘發(fā)炎癥痛敏反應，導致縮

23、足反射的潛伏期縮短。應用CCL2的天然受體CCR2的拮抗劑RS504393，可以抑制CCL2誘發(fā)的炎性痛敏反應。
　　CFA注射1d后，C57BL/6表現出持續(xù)的機械痛敏及熱痛敏行為學表型。而腹腔注射RS504393后，CFA導致的機械痛敏及熱痛敏被顯著地抑制。CFA注射1d后，C57BL/6表現出的持續(xù)機械痛敏及熱痛敏可以被NR2B的抑制劑Ifenprodil所阻斷。
　　2.炎癥損傷后CCL2和CCR2表達上調實時定量P

24、CR(Real-time PCR)顯示脊髓的CCR2 mRNA的表達在CFA導致的炎性痛中明顯上調。通過Western blot研究發(fā)現CCL2可以顯著增強NR2B的蛋白水平，而腹腔注射RS504393可以減弱這種表達增強。
　　3.CCL2致痛敏作用的細胞分子機制通過在神經元上進行全細胞膜片鉗實驗以及單細胞PCR發(fā)現，5例Lamina II神經元上中的4例神經元可以誘導出NMDA電流，并且其中的兩例CCL2可增強NMDA誘發(fā)電流

25、，提示NMDA受體與CCR2可共表達;單細胞PCR實驗發(fā)現可以誘發(fā)NMDA電流的神經元同時也表達囊泡谷氨酸轉運體2;表達囊泡抑制性氨基酸轉運體的抑制性神經元并不能誘發(fā)NMDA電流，提示NMDA受體可能不表達在抑制性神經元上。
　　Westen blot實驗發(fā)現，CCL2可以直接增強神經元PERK的水平，同時這種增強作用可以被細胞內加入PERK的阻斷劑PD98059所阻斷，同時也可被細胞外加入CCR2抑制劑RS504393所阻斷。<

26、br>　　電生理學實驗結果進一步顯示，表面灌流CCL2(100 ng/ml)可以導致NMDA電流的顯著增加，而這種增加可以被CCR2的拮抗劑RS504393所阻斷。同時發(fā)現CCL2可以增強CFA致炎性痛敏動物Lamina II神經元的NMDA電流。突觸的電生理學實驗表明，表面灌流CCL2/MCP-1 2 min并不能增強AMPAR介導的誘發(fā)興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic current,e

27、EPSC)，但是顯著增強了NMDAR介導的eEPSC。表明CCL2可以直接或者間接作用于突觸后NMDA受體從而引發(fā)突觸后作用。
　　在CFA注射24 h后炎性痛敏動物脊髓背角Lamina II神經元表面灌流CCR2拮抗劑RS504393可以在短時間內(<2 min)顯著降低NMDA誘發(fā)電流。應用NR2B的特異性阻斷劑Ifenprodil，可以部分阻斷脊髓背角Lamina II神經元上的NMDA電流，同時也可以阻斷CCL2對NMDA

28、電流的增強作用。
　　應用在體電生理實驗技術，在麻醉動物脊髓背角記錄場電位EPSP(fEPSP)給予強直條件刺激后，可以在脊髓背角誘發(fā)fEPSP的增強，這種增強可以持續(xù)數小時。研究發(fā)現，在體脊髓誘發(fā)的LTP可以被RS504393翻轉。
　　結論:1.在生理狀態(tài)下，脊髓背角第一級突觸的突觸前NMDA受體，對傷害性信號的突觸傳遞主要發(fā)揮抑制性調控作用。
　　2.在慢性炎癥病理狀態(tài)下，脊髓背角第一級突觸的突觸前NMDA受體發(fā)