盧非酰胺選擇性抑制C纖維介導的傷害性初級傳入發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用.pdf

1、疼痛（pain）是由傷害性刺激引起的復雜生理心理活動，在正常情況下，是機體重要的警告信號，當傷害性刺激發(fā)生時，機體通過全身皮膚和有關組織中分布的的傷害性感受器將各種形式的刺激轉換成神經沖動的電活動信號，沿著傳入神經，背根神經節(jié)到達脊髓背角或三叉神經脊束核中的相關神經元，再由對側的腹外側索傳至丘腦、其他腦區(qū)以及大腦皮質，產生痛覺，從而對有害刺激做出回避反應。另一方面，過度的疼痛會產生負面影響，長期的劇烈疼痛會對機體產生難以忍受的精神和軀體

2、的折磨，所以減輕異常疼痛，提高人類生活質量始終是醫(yī)學研究的關注點。介導疼痛的傳導通路及分子作用復雜，在疼痛機制的研究長河中各種學說層出不窮。其中，作為疼痛四大學說之一的閘門控制學說相對比較確切的闡述了病理性疼痛的發(fā)生機制，認為在整個痛覺的傳導過程中，脊髓背角膠狀質（Substantia gelatinosa，SG）中的某些神經細胞控制著痛覺信息的傳遞，作用機理類似閘門的開放，這些神經元本身就受粗、細纖維傳入活動和高級中樞下行控制作用的影

3、響，本學說的提出為揭示疼痛的發(fā)生機制開辟了新的方向，基于此理論，我們意識到，脊髓背角膠狀質作為疼痛傳導的中樞起著信息轉換的重要作用，必然也是研究開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物的重要靶點。癲癇是因腦部神經元異常放電引起的一組臨床綜合征，由已知或未知病因引起，臨床特征表現(xiàn)為反復、短暫、刻板的神經系統(tǒng)功能失常。隨著人類醫(yī)學研究的不斷進步，新時期提出的整合醫(yī)學認為將相關各領域最先進的醫(yī)學發(fā)現(xiàn)加以整合可以形成更加全面的醫(yī)學知識體系。隨著人們對癲癇和疼痛機制研究

4、的不斷深入，循著整合醫(yī)學的方向，查閱資料后我們發(fā)現(xiàn)癲癇和疼痛的的發(fā)病機制部分類似。新型抗癲癇藥物盧非酰胺屬于三唑類衍生物，目前臨床作為輔助治療藥物應用于4歲以上兒童和成人Lennox-Gastant綜合征（LGS）相關癲癇發(fā)作。研究發(fā)現(xiàn)它不僅在癲癇的治療上作用顯著，而且具有潛在的鎮(zhèn)痛作用，與此同時，它具有穩(wěn)定情緒的獨特優(yōu)勢。近年來，盧非酰胺已經成功用于癲癇疾病的治療，但是鎮(zhèn)痛機制尚不明確，尤其是對疼痛重要調節(jié)位點的脊髓背角膠狀質神經元及

5、其突觸傳遞的作用機制缺乏有力的研究報道。
　　本課題主要利用動物行為學測試技術、膜片鉗全細胞記錄探討盧非酰胺對脊髓背角SG神經元的興奮性以及對傷害性刺激突觸傳遞的影響，為闡明盧非酰胺的脊髓背角鎮(zhèn)痛機制提供實驗依據(jù)。
　　實驗一：盧非酰胺對腰5脊神經結扎（Spinal nerve ligation，SNL）神經病理性疼痛大鼠模型的鎮(zhèn)痛作用
　　目的：觀察抗癲癇藥物盧非酰胺對腰5脊神經結扎神經病理性疼痛大鼠模型（SNL）的

6、機械、熱痛覺超敏的影響。
　　方法：選取180～220g雄性SD大鼠，于SNL模型制作前3d給予連續(xù)的相同時間同一環(huán)境適應，前1d測定大鼠疼痛基礎閾值。選取疼痛閾值在正常范圍內的大鼠制備腰5脊神經結扎（SNL）神經病理性疼痛動物模型。術后5d同一時間測試機械性縮足反射閾值、熱痛縮足反射潛伏時間，若疼痛閾值未下降或出現(xiàn)后足偏癱，行為異常視為造模失敗，剔除出組。神經病理性疼痛動物模型被隨機分為三組：（1）大劑量實驗組：將50 mg/k

7、g盧非酰胺溶入1％DMSO中，生理鹽水稀釋至1ml，單次腹腔注射。（2）小劑量實驗組：25 mg/kg盧非酰胺溶入1%DMSO中用生理鹽水稀釋至1ml單次腹腔注射。（3）對照組：與實驗組等體積、等比例的1%DMSO單次腹腔注射。分別于注射后20 min、40 min、60 min、4 h、12 h、24 h進行行為學評估。觀察盧非酰胺對大鼠L5神經損傷后形成的神經病理性疼痛的鎮(zhèn)痛效果。結果：SNL術前對大鼠基礎疼痛閾值進行測定，左、右后

8、足機械性縮足反射閾值(PWMT)分別為（21.87±5.69）g和（18.33±4.18）g，熱痛縮足反射潛伏時間(TWL)為（24.43±3.32）s和（22.31±4.28）s，無統(tǒng)計學差異。術后第5 d，形成穩(wěn)定神經病理性疼痛，與術前相比，左后足的閾值顯著降低至（6.00±2.13）g（P＜0.001，one-way ANOVA，n=22），熱痛縮足反射潛伏時間降為（13.45±2.17）s（P＜0.001，one-way ANO

9、VA，n=22），證實模型建立成功。當腹腔注射不同濃度的盧非酰胺后，測試機械、熱痛閾值發(fā)現(xiàn)兩種濃度的盧非酰胺均可以顯著緩解已形成的慢性疼痛，并且鎮(zhèn)痛作用具有明顯的濃度依賴性，并在給藥后1h作用達到高峰，與溶劑組相比可顯著提升大鼠術側機械性縮足反射閾值至（19.99±7.17）g和（17.00±7.32）g（P<0.001，one-way ANOVA，n=8），增加熱痛縮足反射潛伏時間至（16.23±3.14） s和（19.90±2.41

10、）s（P<0.001，one-way ANOVA，n=8）這一作用可維持至注藥后12 h。
　　實驗二：盧非酰胺對脊髓背角膠狀質（SG）神經元興奮性的影響
　　目的：應用膜片鉗全細胞記錄技術，在脊髓矢狀位切片上觀察盧非酰胺對SG神經元動作電位（Action potential，AP）發(fā)放頻率的影響。
　　方法：取4～5周齡雄性SD大鼠，制備厚度為400-500μm帶后根的脊髓腰骶膨大段矢狀位切片。低倍鏡下確定脊髓背角淺

11、層，高倍鏡下選擇狀態(tài)較好的SG神經元做全細胞記錄，鉗制電流為0 pA，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定5 min后。觀察盧非酰胺對SG神經元動作電位發(fā)放頻率的影響。
　　結果：抗癲癇藥物盧非酰胺可顯著減少脊髓背角 SG神經元動作電位的發(fā)放頻率（P<0.01，paired t-test），給予一段時間洗脫，盧非酰胺的抑制作用被成功逆轉（P<0.01，paired t-test）。
　　實驗三：盧非酰胺對傷害性感覺通路突觸傳遞的選擇性抑制作用

12、r>　　目的：全細胞記錄，電壓鉗模式下給予后根刺激，觀察抗癲癇藥物盧非酰胺對中等直徑 Aδ纖維和小直徑 C纖維介導的脊髓背角 SG神經元的興奮性突觸后電流（eEPSCs）及自發(fā)性興奮性突觸后電流（sEPSCs）的影響。
　　方法：同實驗二，制備SD大鼠脊髓切片，選取SG神經元，鉗制電壓為-70 mV,給予從小到大的后根恒壓電刺激，先記錄給藥前誘發(fā)的興奮性突觸后電流（eEPSCs）15條曲線，平均后作為對照，浴槽內不間斷灌流200μ

13、M盧非酰胺1 min后相同方法再次記錄，根據(jù)文獻報道不同的纖維傳導具有的電生理特異性，對記錄的細胞進行分類統(tǒng)計。（1）觀察盧非酰胺對Aδ纖維介導的eEPSCs的作用。（2）觀察盧非酰胺對C纖維介導的eEPSCs的作用（。3）觀察盧非酰胺對脊髓背角SG神經元sEPSCs的影響。
　　結果：（1）單次灌流不同濃度的盧非酰胺對Aδ纖維介導的eEPSCs幾乎不產生影響（P＞0.05，paired t-test）。（2）盧非酰胺可顯著抑制C

14、纖維介導的eEPSCs的峰值（P<0.01，paired t-test）。（3）盧非酰胺灌流可以明顯抑制SG神經元sEPSCs的發(fā)放頻率（P<0.001，paired t-test），但對其幅度沒有明顯影響（P＞0.05，paired t-test）。
　　結論：
　　1.單次腹腔注射不同濃度的盧非酰胺均可以有效緩解已形成的慢性疼痛，鎮(zhèn)痛作用在給藥后1h達到高峰且具有濃度依賴性。
　　2.盧非酰胺可以顯著抑制脊髓背角