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文檔簡介
1、自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)主要包括 Graves’病(GD)和橋本甲狀腺炎(HT)兩種類型。兩種疾病都受特定甲狀腺自身抗原,如甲狀腺過氧化物酶(TPO)甲狀腺球蛋白(TG),和/或 TSH受體(TSHR)的自身抗體(aAbs)的作用。GD和 HT中的甲狀腺功能亢進(jìn)癥/減退癥可以視為 AITD連續(xù)譜的兩端,兩種疾病在該連續(xù)譜中存在大量的重疊區(qū)間。不僅在幾乎所有 HT患者中 TPOAb和/或 TGAb滴度增高,而且在70%的 GD患者
2、中這兩種抗體滴度也增高。甲狀腺功能減退癥源于長期慢性自身免疫性甲狀腺炎, Graves’甲亢患者使用抗甲狀腺藥物進(jìn)入緩解后最終有多達(dá)20%的患者轉(zhuǎn)變?yōu)榧谞钕俟δ軠p退癥;阻斷 TSHRAb對(duì)于甲狀腺功能減退癥的發(fā)病貢獻(xiàn)了三分之一,而慢性自身免疫性甲狀腺炎貢獻(xiàn)了其余的三分之二。
甲狀腺除了分泌甲狀腺激素以外還能產(chǎn)生一系列免疫活性因子,如粘附分子、生長因子、炎癥介質(zhì)(一氧化氮和前列腺素),當(dāng)然還有細(xì)胞因子。除了對(duì)靶細(xì)胞的生長和分化發(fā)
3、揮關(guān)鍵作用以外,這些分子還調(diào)節(jié)許多甲狀腺疾病的易感性。據(jù)報(bào)道,許多細(xì)胞因子,包括 IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13和 IL-15由甲狀腺細(xì)胞合成,其中 IL-1可以刺激甲狀腺細(xì)胞增殖并抑制甲狀腺激素的合成和釋放的幾個(gè)步驟。它也刺激甲狀腺產(chǎn)生其他細(xì)胞因子,如 IL-6和 IL-8,破壞甲狀腺上皮屏障,并影響甲狀腺細(xì)胞功能。實(shí)際上,IL-1下調(diào)甲狀腺特異性蛋白,如 Tg和 TPO的表達(dá),抑制碘化作用和 Na+/I
4、-同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS),并減少甲狀腺激素向血循環(huán)的釋放。IL-1家族由 IL-1α, IL-1β,和 IL-1受體拮抗劑(IL-1Rα)組成。IL-1β主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,它與 IL-1α具有類似的結(jié)構(gòu)和生物活性,是人類IL-1家族的主要成員。
到目前為止, IL-1β在AITD中的病理生理學(xué)和診斷學(xué)意義仍然尚不明確。在本研究中,我們檢測了 HT,GD患者和正常對(duì)照組的血清IL-1β水平,發(fā)現(xiàn)并無統(tǒng)計(jì)差異。而外周血單個(gè)核
5、細(xì)胞(PBMC)中,HT組IL-1βmRNA和蛋白水平均明顯高于 GD和正常對(duì)照組。此外, HT患者甲狀腺組織的 IL-1βmRNA水平也高于GD患者,這可能與 HT患者的甲狀腺組織局部浸潤更多的的單核細(xì)胞也有關(guān)系。臨床資料的相關(guān)分析證實(shí)了IL-1β的高表達(dá)與 HT的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。這些結(jié)果提示:IL-1β是參與橋本甲狀腺炎發(fā)病機(jī)質(zhì)的一個(gè)活躍的因子,可能會(huì)成為一種很有前途的診斷/治療靶點(diǎn)。
材料與方法:
1.患者
6、> 本研究納入自2013年6月至2014年11月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的患者,其中新診斷的女性 HT患者12例,年齡20至52歲(平均年齡37.58±9.29歲);女性 GD患者12例,年齡25至51歲(平均年齡37.92±9.89);20名正常女性志愿者作為正常對(duì)照組,年齡18至50歲(平均年齡34.35±9.32歲)。
2.血液樣本和甲狀腺組織切片采集
采集患者和志愿者的外周血樣本,轉(zhuǎn)速200×g,4℃
7、離心5分鐘,收集上層血清并儲(chǔ)存在-80℃冰箱中用于 IL-1β的檢測。使用標(biāo)準(zhǔn) Ficoll-Hypaque以密度離梯度方法離心分離獲得 PBMC,加入 Trizol,儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)用于提取總 RNA。收集甲狀腺腺瘤旁正常甲狀腺組織標(biāo)本, HT和 GD的甲狀腺組織標(biāo)本儲(chǔ)存在液氮中。
3.免疫組織化學(xué)
將石蠟包被的甲狀腺組織制成5μm厚度的切片,使用二甲苯脫蠟。用微波方法30分鐘作用于透明的切片完成抗原修復(fù)。以稀
8、釋的正常山羊血清封閉。用0.3%過氧化氫-甲醇處理切片,封閉內(nèi)源性過氧化物酶。目標(biāo)抗原使用1:100抗-CD14(Abcam)或1:150抗-CD64(Abcam)孵育過夜用以檢測。一抗標(biāo)記過后使用帶有辣根過氧化物酶的二抗( Santa Cruz Biotechnology)和3,3′-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(Life Technologies)著色。切片使用蘇木精復(fù)染色,然后清洗并固定。
4.引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件
根據(jù)
9、Genbank序列,使用 Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程技術(shù)和服務(wù)公司合成引物。所有引物序列見正文表1。
5.RNA的提取及 cDNA的合成
按照試劑盒制造商的說明書,使用 Trizol(Ambion, Carlsbad, CA, USA)從 PBMC和甲狀腺組織中提取總 RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, C
10、A, USA)合成cDNA.。所有 RNA樣本予65 ℃加熱10分鐘使得二級(jí)結(jié)構(gòu)模板變性然后立即在冰上冷卻5分鐘???RNA參照之前的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄[17]。
6.Real-time PCR分析
使用 Trizol從 PBMC或甲狀腺組織中提取總 RNA。取1μg總 RNA合成 cDNA,按照試劑盒說明書步驟,分別加入各自引物及 iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad
11、 Laboratories, USA),使用 Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR系統(tǒng)(Life Technologies, USA)檢測 mRNA的表達(dá)水平?;虮磉_(dá)量用2–△△Ct相對(duì)量表示。目的基因表達(dá)水平以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,結(jié)果以和內(nèi)參相比較的循環(huán)數(shù)(Ct)差值來體現(xiàn)。
7.血清 IL-1β的 Quantiglo ELISA測定
按照試劑盒制
12、造商的說明書(R&D Systems, Catalog Number QLB00B,USA),采用 Quantiglo ELISA方法測定血清 IL-1β水平。所有樣本均檢測三次。
8.化學(xué)發(fā)光法測定血清T3,T4,TSH,ATG和TPOAb
按照試劑盒制造商的說明書(SIEMENS ADVIA Centaur XP Immunoassay System, USA)采用化學(xué)發(fā)光法測定血清 T3, T4, TSH, A
13、TG和 TPOAb水平。所有樣本均檢測三次。
9.放射免疫分析法測定血清TSHRAb
按照試劑盒制造商的說明書(Union Medical Science&Technology Co., Ltd., Tianjin,China)采用放射免疫分析法測定血清 TSHRAb水平。所有樣本均檢測三次。
10.流式細(xì)胞檢測分析
采用 BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Per
14、meabilization試劑盒(BD Biosciences, Oxford, UK)進(jìn)行細(xì)胞預(yù)處理及染色。
按照試劑盒說明書,細(xì)胞采用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗-CD64抗體(BD Pharmingen)染色,然后使用藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗-IL-1?抗體(BD Pharmingen)胞內(nèi)染色。使用 Beckman FC500流式細(xì)胞分析儀(Cytomics FC500, Beckman Coulter, Bre
15、a, CA, USA)檢測待測細(xì)胞,獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用 Beckman FC500CXP軟件進(jìn)行分析。
11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
使用 SPSS17.0(SPSS, Chicago, IL, USA)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在正文及圖表中,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)的形式呈現(xiàn)。采用合適的Student’st檢驗(yàn)的方法比較組間配對(duì)的或非配對(duì)數(shù)據(jù)。對(duì)于非參數(shù)數(shù)據(jù),采用 Mann–Whitney檢驗(yàn)分析組間差異。采用 Pea
16、rson相關(guān)分析測試兩個(gè)連續(xù)變量之間的相關(guān)性。p<0.05被視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
結(jié)果:
1.HT組與 GD組和正常對(duì)照組相比,PBMC中的IL-1β表達(dá)增高
正如之前所述,目前認(rèn)為多種促炎細(xì)胞因子參與了AITD的發(fā)病機(jī)制。我們采用 qRT-PCR分析方法檢測了AITD患者及正常對(duì)照 PBMC中一系列 Th1/Th2細(xì)胞因子以及 IL-1β的mRNA水平。結(jié)果顯示三組間 IL-4,INF-γ, TNF-α和
17、 IL-13 mRNA水平無顯著性差異,而 HT組 PBMC中的 IL-1β的 mRNA水平顯著增高,幾乎是 GD組的3倍。而 GD組 PBMC中的 IL-1β的mRNA又幾乎是正常對(duì)照組的7倍。這意味著,兩組 AITD患者( GD和HT) PBMC中的IL-1βmRNA水平與正常對(duì)照相比均增高。
此外,我們還檢測了 GD組、 HT組和正常對(duì)照組 PBMC中的 IL-1β蛋白水平。PBMC細(xì)胞采用 CD64和 IL-1β雙抗體
18、染色,然后通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。HT組(n=9) PBMC中 IL-1β/CD64的比例為67.17%~98.49%,明顯比 GD組(n=7)的23.19%~51.35%和正常對(duì)照組(n=8)的5.22%~18.42%高。此結(jié)果與之前的 qPCR數(shù)據(jù)相吻合。這些結(jié)果顯示:無論是在 mRNA水平還是在蛋白水平, HT組 PBMC中的 IL-1β均明顯高于 GD組,而正常對(duì)照組 PBMC中的 IL-1β是最低的。
2.HT組、G
19、D組和正常對(duì)照組的血清 IL-1β水平無顯著性差異
我們采用 Quantiglo ELISA分析進(jìn)一步檢測了 HT組(n=12), GD組(n=12)患者和正常對(duì)照組(n=20)血清中的 IL-1β蛋白水平。與 PBMC中所得到的數(shù)據(jù)不同, HT組, GD組和正常對(duì)照組血清 IL-1β水平分別為0.47360±0.21313 pg/mL,0.46241±0.05170 pg/mL和0.52672±0.13024 pg/mL,三
20、組間無顯著性差異。
3.HT組與 GD組和正常對(duì)照組相比,甲狀腺組織中的 IL-1β表達(dá)量明顯增高
除了對(duì) PBMC中 IL-1β的水平進(jìn)行檢測以外,我們還進(jìn)一步采用 qRT-PCR方法分析了 HT、 GD患者及甲狀腺腺瘤患者(取腺瘤周圍正常甲狀腺組織)甲狀腺組織中 IL-1β的表達(dá)水平。與PBMC中的研究數(shù)據(jù)一致的是,研究結(jié)果顯示: IL-1βmRNA在GD甲狀腺組織中的水平幾乎僅僅是 HT甲狀腺組織中的一半,而
21、GD患者與甲狀腺腺瘤患者之間甲狀腺組織中的 IL-1βmRNA水平無顯著性差異。這一結(jié)果與 Giordano C等采用免疫組化方法證實(shí)的 HT患者甲狀腺組織中 IL-1β高水平表達(dá)的結(jié)果相一致。
此外,我們還采用免疫組化分方法對(duì)于甲狀腺組織中單核-巨噬細(xì)胞的浸潤情況進(jìn)行分析。IL-1β主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,我們分別采用 CD64和 CD14抗體對(duì)單核-巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記。HT患者甲狀腺組織樣本切片陽性染色細(xì)胞浸潤明顯超過
22、了GD樣本和甲狀腺腺瘤周圍正常甲狀腺組織樣本。
4.L-1β水平與HT組和GD組患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析
為了探索不同IL-1β水平在AITD患者中發(fā)揮的潛在作用,該分析招募了12名女性GD患者,12名女性HT患者,以及20名女性正常對(duì)照者。各組間在年齡分布上無顯著性差異。各組間血清 T3,T4,TSH, ATG以及TPOAb水平存在顯著性差異(所有提到的指標(biāo),p<0.05),這與各組的診斷相映證。我們將每個(gè)組的數(shù)據(jù)
23、分別單獨(dú)分析,發(fā)現(xiàn)血清 IL-1β水平以及PBMC IL-1β水平與這些血清學(xué)指標(biāo)均無相關(guān)性。然而,將所有3組數(shù)據(jù)集中分析,發(fā)現(xiàn) PBMC IL-1βmRNA水平與血清ATG(r=0.711,p<0.001)及血清 TPOAb(r=0.713, p<0.001)呈正相關(guān)??傊狙芯拷Y(jié)果提示 PBMC中的 IL-1β水平與血清ATG及TPOAb水平呈正相關(guān)。
結(jié)論:
我們的研究表明, IL-1β參與自身免疫性甲狀腺疾
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