MitoNEET在細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)外鐵硫簇轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用.pdf

1、目的:
　　人線(xiàn)粒體蛋白mitoNEET是新近發(fā)現(xiàn)的由核基因編碼的定位在線(xiàn)粒體外膜上的低分子量蛋白，其含有一個(gè)[2Fe-2S]型鐵硫中心，該鐵硫中心由Cys72、Cys74、Cys83及His87四個(gè)氨基酸殘基配位結(jié)合。MitoNEET作為抗2型糖尿病藥物吡格列酮的靶蛋白而被發(fā)現(xiàn)，廣泛分布于真核和原核生物系統(tǒng)中，其可能參與多種生命活動(dòng)過(guò)程，包括細(xì)胞自噬、凋亡、老齡化、糖尿病及體內(nèi)活性氧的平衡等。體外實(shí)驗(yàn)中，mitoNEET蛋白可以

2、直接將鐵硫簇傳遞給目的蛋白，如fdx、aconitase1等;但其在細(xì)胞水平線(xiàn)粒體內(nèi)外鐵硫簇傳遞中的作用仍不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究細(xì)胞中mitoNEET不同表達(dá)情況下線(xiàn)粒體內(nèi)外鐵硫簇水平變化，從而分析mitoNEET在細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)外鐵硫簇轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。
　　方法:
　　1.構(gòu)建mitoNEET干擾質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo-mitoNEET。培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞與肝癌HepG2細(xì)胞，分別篩選其G418最低藥物

3、致死濃度。在MCF-7和HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mitoNEET干擾質(zhì)粒及其對(duì)照空載，通過(guò)G418藥物篩選出穩(wěn)定低表達(dá)mitoNEET及其對(duì)照細(xì)胞株。
　　2.用熒光定量PCR和western blot測(cè)定細(xì)胞內(nèi)mitoNEET mRNA和蛋白表達(dá)水平，挑選和鑒定最佳干擾效果的穩(wěn)定低表達(dá)mitoNEET及其對(duì)照細(xì)胞株。
　　3.用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定低表達(dá)mitoNEET及其對(duì)照細(xì)胞株的細(xì)胞增殖速率，分析低表達(dá)mitoNEE

4、T對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　4.測(cè)定穩(wěn)定低表達(dá)mitoNEET及其對(duì)照細(xì)胞株線(xiàn)粒體內(nèi)的鐵硫蛋白活性和蛋白表達(dá)情況，從而反映線(xiàn)粒體內(nèi)鐵硫簇水平，包括aconitase2、complexⅠ和硫辛酸合成酶。同時(shí)測(cè)定細(xì)胞質(zhì)中的鐵硫蛋白活性和蛋白表達(dá)情況以反映細(xì)胞質(zhì)鐵硫簇水平，包括acoritase1和二氫嘧啶脫氫酶。比較低表達(dá)mitoNEET及其對(duì)照細(xì)胞株的細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)外鐵硫簇水平差異，從而分析mitoNEET蛋白在細(xì)胞線(xiàn)粒體鐵硫簇轉(zhuǎn)運(yùn)中的

5、作用。
　　5.構(gòu)建重組mitoNEET野生型高表達(dá)質(zhì)粒，用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mitoNEET野生型高表達(dá)質(zhì)粒使細(xì)胞高表達(dá)mitoNEET，用熒光定量PCR和westemblot鑒定此時(shí)細(xì)胞內(nèi)mitoNEET mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　6.轉(zhuǎn)染mitoNEET野生型高表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒，48h后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)aconitase1、2的蛋白表達(dá)水平和酶活性，從而檢測(cè)高表達(dá)mitoNEET對(duì)細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)外鐵

6、硫簇水平變化的影響。
　　7.利用定點(diǎn)突變構(gòu)建mitoNEET突變型高表達(dá)質(zhì)粒(H87C和H87S)。在穩(wěn)定低表達(dá)mitoNEET細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染mitoNEET野生型和突變型高表達(dá)質(zhì)粒載體進(jìn)行rescue實(shí)驗(yàn)。用熒光定量PCR和western blot鑒定細(xì)胞內(nèi)mitoNEET mRNA和蛋白表達(dá)水平從而分析rescue對(duì)mitoNEET表達(dá)的恢復(fù)情況。
　　8.在如上轉(zhuǎn)染mitoNEET野生型和突變型(H87C和H87S)高

7、表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞中測(cè)定胞質(zhì)aconitase1的蛋白表達(dá)和酶活性，分析rescue對(duì)mitoNEET細(xì)胞鐵硫簇傳遞功能的影響。
　　結(jié)果:
　　1.穩(wěn)定低表達(dá)mitoNEET細(xì)胞株的篩選、鑒定以及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　利用RNAi干擾技術(shù)和G418藥物篩選獲得穩(wěn)定低表達(dá)mitoNEET細(xì)胞株及其對(duì)照細(xì)胞株。低表達(dá)mitoNEET細(xì)胞株的mitoNEET mRNA和蛋白表達(dá)均顯著性的低于未處理和對(duì)照細(xì)胞株。另外相對(duì)于未處

8、理和對(duì)照細(xì)胞株，mitoNEET低表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞增殖速率顯著性的下降。
　　2.低表達(dá)mitoNEET對(duì)線(xiàn)粒體內(nèi)外鐵硫簇水平的影響。
　　低表達(dá)mitoNEET不影響線(xiàn)粒體內(nèi)aconitase2的蛋白表達(dá)水平和酶活性，同時(shí)complexⅠ和硫辛酸合成酶的酶活性也沒(méi)有明顯的變化。另一方面，低表達(dá)mitoNEET后細(xì)胞質(zhì)中aconitase1蛋白表達(dá)不變，而其酶活性顯著降低。但是細(xì)胞質(zhì)中的二氫嘧啶脫氫酶的酶活性在低表達(dá)mitoN

9、EET之后并沒(méi)有顯著性變化。
　　3.高表達(dá)mitoNEET對(duì)線(xiàn)粒體內(nèi)外鐵硫簇水平的影響。
　　通過(guò)在MCF-7細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染高表達(dá)mitoNEET的野生型質(zhì)粒載體從而構(gòu)建高表達(dá)mitoNEET細(xì)胞模型，其mitoNEET mRNA和蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞顯著性的增加。高表達(dá)mitoNEET對(duì)細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)外aconitase1、2的酶活性和蛋白表達(dá)水平均沒(méi)有明顯影響。
　　4.Rescue對(duì)mitoNEET細(xì)胞鐵硫簇轉(zhuǎn)

10、運(yùn)功能的影響。
　　在穩(wěn)定低表達(dá)mitoNEET細(xì)胞株中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染高表達(dá)mitoNEET野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒(H87S、H87C)均使細(xì)胞內(nèi)mitoNEET mRNA和蛋白表達(dá)顯著性的增加。轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒的細(xì)胞可以恢復(fù)aconitase1的酶活性同時(shí)不影響其蛋白表達(dá);轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒的細(xì)胞(H87C和H87S)雖然能使細(xì)胞中mitoNEET的mRNA和蛋白表達(dá)水平恢復(fù)，但是不能使之前低表達(dá)mitoNEET導(dǎo)致降低的aconitase

11、1酶活性恢復(fù)，同時(shí)此過(guò)程中aconitase1的蛋白表達(dá)也沒(méi)有明顯變化。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了穩(wěn)定低表達(dá)mitoNEET和其對(duì)照細(xì)胞株。MitoNEET會(huì)抑制細(xì)胞增殖速率。低表達(dá)mitoNEET不影響細(xì)胞質(zhì)中aconitase1蛋白水平而降低其酶活性，對(duì)其他線(xiàn)粒體內(nèi)外鐵硫蛋白活性無(wú)明顯影響。結(jié)果表明mitoNEET參與傳遞細(xì)胞鐵硫簇給細(xì)胞質(zhì)中的aconitase1。
　　高表達(dá)mitoNEET不影響線(xiàn)粒體內(nèi)

12、外鐵硫簇水平，aconitase1、2的蛋白表達(dá)和酶活性均沒(méi)有顯著變化。表明細(xì)胞中正常表達(dá)的mitoNEET已能夠發(fā)揮其鐵硫簇傳遞功能，過(guò)表達(dá)對(duì)其細(xì)胞鐵硫簇傳遞功能沒(méi)有影響。
　　在低表達(dá)mitoNEET細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染野生型mitoNEET表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞可以恢復(fù)其細(xì)胞質(zhì)的aconitase1的酶活性同時(shí)不影響該蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染mitoNEET突變型(H87C和H87S)表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞雖然能使細(xì)胞中mitoNEET mRNA和蛋白表達(dá)水