大腸桿菌和人IscA蛋白體內(nèi)外鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究.pdf

1、目的：
　　 為研究大腸桿菌和人類IscA蛋白在體內(nèi)的鐵結(jié)合活性以及在鐵硫簇合成過程中發(fā)揮的作用，在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，在M9培養(yǎng)基中添加和不添加外源鐵，純化后比較兩者鐵結(jié)合情況；并且在有氧和無氧條件下比較大腸桿菌IscA鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的差異，從而較全面地闡述大腸桿菌和人類IscA的生理功能。
　　 方法：
　　 1．大腸桿菌IscA蛋白鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究
　　 1)大腸桿菌I

2、scA體內(nèi)鐵結(jié)合活性
　　 將構(gòu)建好的pET28b-E.coliIscA、pET28b-E.coliIscU、pET28b-E.coliSufA、pET28b-E.coliCyay表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中，在添加和不添加外源鐵的M9培養(yǎng)基中用IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。通過鎳柱親和層析純化目的蛋白并用紫外分光光度計(jì)全波長掃描蛋白樣品，比較鐵結(jié)合情況。為進(jìn)一步證明大腸桿菌IscA體內(nèi)結(jié)合鐵活力，不同濃度外源鐵添加入M9培養(yǎng)

3、基中，用EPR方法檢測細(xì)胞內(nèi)自由鐵的相對濃度，并在同樣實(shí)驗(yàn)條件下測定體內(nèi)表達(dá)的IscA的鐵結(jié)合含量。
　　 2)氧化還原條件對大腸桿菌IscA體內(nèi)外結(jié)合鐵活性的影響在無氧和有氧條件下，分別在添加有2μM外源鐵的M9培養(yǎng)基中表達(dá)和純化大腸桿菌IscA和SufA，比較有氧和無氧時體內(nèi)鐵結(jié)合含量差異。利用純化的無鐵IscA在無氧和有氧條件下體外與鐵進(jìn)行結(jié)合，比較差異。并進(jìn)一步闡明在氧化和還原狀態(tài)下IscA鐵結(jié)合活性的差異。
　　

4、 3)大腸桿菌IscA在體外有氧和無氧條件對鐵硫簇合成的不同作用分別在無氧或者有氧條件下，用游離二價鐵或者結(jié)合到IscA上的重組鐵，在IscS、IscU、L-半胱氨酸存在的體系中孵育，并用紫外分光光度計(jì)掃描反應(yīng)體系，監(jiān)測IscU上的鐵硫簇的體外組合情況。
　　 2．人IscA蛋白鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究
　　 1)人IscA在大腸桿菌體內(nèi)鐵結(jié)合活性
　　 將構(gòu)建好的pET28b-hIscA1、pET28b-

5、humanFrataxin轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中，在添加或者不添加外源鐵的M9培養(yǎng)基中用IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。利用上述研究大腸桿菌IscA體內(nèi)鐵結(jié)合活性一樣的方法，分別比較其體內(nèi)鐵結(jié)合活性。
　　 2)人IscA對大腸桿菌體內(nèi)外鐵硫簇合成的替代作用用含有飽和鐵的人IscA蛋白和大腸桿菌IscS、IscU和L-半胱氨酸同時孵育，并用紫外分光光度計(jì)掃描反應(yīng)體系，監(jiān)測IscU上的鐵硫簇的體外組合情況。另外將構(gòu)建好的pBAD-h

6、IscA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌IscA-/SufA-基因雙敲除菌株中，用低濃度L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，觀察菌株生長狀態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1．大腸桿菌IscA蛋白鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究
　　 1)大腸桿菌IscA體內(nèi)鐵結(jié)合活性在不加鐵的M9培養(yǎng)基表達(dá)純化出來的大腸桿菌IscA和同源蛋白SufA含有數(shù)量可忽略不計(jì)的鐵；在添加有外源鐵的培養(yǎng)基中表達(dá)純化出來的大腸桿菌IscA和SufA在315nm處有一個較高的特異性吸

7、收峰，表明結(jié)合了相當(dāng)數(shù)量的鐵；但是在同樣實(shí)驗(yàn)條件下，大腸桿菌IscU、Cyay不能結(jié)合鐵。在添加不同鐵濃度的M9培養(yǎng)基中純化出來的IscA在315nm處的鐵結(jié)合峰的高度呈現(xiàn)飽和滴定曲線，和細(xì)胞內(nèi)自由鐵含量滴定曲線相一致。
　　 2)氧化還原條件對大腸桿菌IscA體內(nèi)外結(jié)合鐵活性的影響在無氧條件下，IscA體內(nèi)外結(jié)合鐵的活性都顯著下降。對IscA的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，二價鐵只有被氧化成三價鐵才能結(jié)合IscA，而和IscA結(jié)合的三價鐵被

8、還原成二價鐵后與IscA分離。
　　 3)大腸桿菌IscA在體外有氧和無氧條件對鐵硫簇合成的不同作用游離二價鐵暴露在空氣中3h即被完全氧化成三價鐵，并生成氫氧化三鐵沉淀，不能參與體外鐵硫簇的合成。而與IscA結(jié)合的鐵能夠在同樣條件下穩(wěn)定存在并提供給鐵硫簇合成。無氧條件下兩者無明顯差別。
　　 2．人IscA蛋白鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究
　　 1)人IscA在大腸桿菌體內(nèi)鐵結(jié)合活性同大腸桿菌IscA類似，在不加

9、鐵的M9培養(yǎng)基表達(dá)純化出來的人IscA含有極微量的鐵；在添加有外源鐵的培養(yǎng)基中表達(dá)純化出來的人IscA在315nm處有一個較高的特異性鐵結(jié)合峰。
　　 2)人IscA對大腸桿菌體內(nèi)外鐵硫簇合成的替代作用結(jié)合鐵的人IscA在體外可以為大腸桿菌鐵硫簇合成系統(tǒng)提供鐵并合成鐵硫簇。而且人IscA基因的導(dǎo)入和誘導(dǎo)表達(dá)，可以使原本不能在M9培養(yǎng)基上存活的大腸桿菌IscA-/SufA-基因雙敲除菌株恢復(fù)緩慢生長。
　　 結(jié)論：