外源性細(xì)胞因子IL-15-IL-10R阻斷劑對HIV-1感染者細(xì)胞免疫應(yīng)答及病毒庫的影響.pdf

1、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，主要由人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染引起的嚴(yán)重傳染病。目前常用的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（HAART）可以有效地抑制HIV的復(fù)制，降低HIV感染者外周血中病毒載量，升高CD4+T細(xì)胞水平，重建HIV/AIDS患者的免疫功能。然而，由于存在患者的依從性問題和病毒耐藥突變等問題，特別是目前的抗病毒治療不能作用到病毒儲藏庫，停藥會導(dǎo)致病毒儲存庫中的整合到宿主基因組中的病毒基因被激活而重新啟動復(fù)制，HIV病

2、毒載量出現(xiàn)快速反彈。這些原因使得艾滋病已成為一種由感染引起的慢性病，需要長期抗病毒治療。
　　HIV感染不能清除的關(guān)鍵在于HIV病毒儲藏庫的持續(xù)存在。HIV傾向于感染CCR5受體陽性的CD4+T淋巴細(xì)胞，感染后的細(xì)胞很快就死亡，其中一小部分遺留下來形成病毒儲藏庫，這些病毒潛伏細(xì)胞在停藥或者外源刺激下可以產(chǎn)生具有復(fù)制能力的HIV病毒。HAART阻斷了絕大部分HIV對細(xì)胞新發(fā)的感染，但已經(jīng)形成的病毒儲藏庫會一直存在。目前認(rèn)為，這些攜帶

3、潛伏HIV的靜止記憶細(xì)胞存在于外周血血細(xì)胞、淋巴結(jié)、腦脊液、精液等。HIV基因組整合在宿主基因組中，并同宿主基因同時復(fù)制，通過潛伏感染記憶性T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞間相互接觸轉(zhuǎn)染維持病毒的持續(xù)感染及病毒庫的更新和穩(wěn)定存在。在某一些抗病毒藥物難以達(dá)到組織或者組織中濃度不足，以及各種隱蔽的組織也可能是病毒持續(xù)存在的原因。
　　由于單純的HAART無法徹底治愈HIV感染，免疫治療作為一種控制HIV感染的新途徑受到人們的關(guān)注。其中非特異性免疫治療

4、作為特異性免疫治療發(fā)展的基礎(chǔ)，以其作用范圍廣，反應(yīng)快，相對穩(wěn)定等特點在抗病毒發(fā)面發(fā)揮著一定的作用。細(xì)胞因子在HIV-1的活化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和維持免疫平衡方面發(fā)揮著重要的作用。
　　IL-15為γ鏈家族成員細(xì)胞因子，能促進(jìn)抗病毒免疫作用中所涉及的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖及促進(jìn)IFN-γ的分泌。在外周血單核細(xì)胞中，能廣泛的活化和誘導(dǎo)T、B及NK細(xì)胞的自然分化和增殖，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的溶細(xì)胞活性，也是記憶CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生及維持的關(guān)鍵

5、細(xì)胞因子。IL-15能促進(jìn)HIV-1感染患者淋巴細(xì)胞在外周血中產(chǎn)生高水平的IFN-γ和一些趨化因子誘導(dǎo)B細(xì)胞和HIV-1特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的增殖。
　　IL-10被證實在慢性HIV-1感染中表達(dá)上調(diào)，在外周血中升高的IL-10水平與病毒載量相關(guān)，并且在體外能介導(dǎo)可逆的細(xì)胞特異性的免疫功能的耗竭，對疾病的進(jìn)展及長期預(yù)后產(chǎn)生重要影響。
　　既往的基礎(chǔ)研究表明，細(xì)胞因子IL-15和IL-10分別具有免疫正向調(diào)節(jié)和負(fù)

6、向調(diào)節(jié)作用，本研究擬通過觀察外源性IL-15及IL-10受體阻斷劑對HIV-1感染者（經(jīng)HARRT和未經(jīng)HARRT的感染者）T淋巴細(xì)胞活化情況、增殖程度及特異性CTL免疫應(yīng)答頻率，及其對HIV-1感染病毒庫的影響，為這些細(xì)胞因子在臨床HIV-1/AIDS疾病治療運用的可能性提供實驗依據(jù)。
　　第一部分 IL-15/IL-10R阻斷劑對HIV-1感染者細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響
　　目的：觀察外源性IL-15及IL-10R阻斷劑對HI

7、V-1感染者（經(jīng)HARRT和未經(jīng)HARRT感染者）T淋巴細(xì)胞活化、增殖及特異性CTL免疫應(yīng)答頻率的影響。
　　方法：以廣州市第八人民醫(yī)院感染科就診的HIV-1感染者為研究對象，以HIV-1 P24編碼區(qū)的氨基酸序列人工合成的12個肽段組成的肽段庫作為HIV-1特異性抗原表位，予以外源性細(xì)胞因子IL-15和/或IL-10R阻斷劑對HIV-1感染者的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行刺激培養(yǎng)。經(jīng)熒光抗體染色后，采用流式細(xì)胞儀檢測記憶T細(xì)

8、胞表面標(biāo)志細(xì)胞活化標(biāo)記CD38、CD45RO、胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)情況（26例已接受HARRT，28例未經(jīng)HARRT）。采用羧乙基鍺倍半氧化物（CFSE）對PBMCs進(jìn)行示蹤染色，刺激培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞的增殖情況（27例已接受HARRT，23例未經(jīng)HARRT）。另外，采用酶聯(lián)免疫斑點吸附技術(shù)（ELISPOT）技術(shù)，檢測HIV-1特異性CTL應(yīng)答頻數(shù)（25例已接受HARRT，27例未經(jīng)HARRT）。對上述已接受HARRT與

9、未經(jīng)HARRT的兩組病例的所有結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析比較。
　　結(jié)果:
　　1、不同刺激條件下 HAART組及 HAART-na?ve組組間及組內(nèi)的 CD38，CD45RO表達(dá)及胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ的變化的比較
　　HIV-1特異性抗原刺激的條件下，在 HAART組中：IL-10受體阻斷劑能有效促進(jìn)CD4+CD38+、CD8+CD38+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+、CD4+IFN-γ、CD8+-IFN-

10、γ T細(xì)胞表達(dá)，但對比單純 P24抗原表位刺激差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。外源性 IL-15及共同作用情況下六種細(xì)胞百分比較單純 P24抗原表位刺激下高（p<0.05）。在HAART-na?ve組中：IL-10R受體阻斷劑作用下六種細(xì)胞百分比較單純P24抗原表位刺激差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），IL-15及兩者共同作用下各細(xì)胞較單純P24抗原表位刺激下差異顯著（P<0.05）。IL-10受體阻斷劑作用下，HAART組與HAAR

11、T-na?ve組，只有CD4+CD38+、CD8+CD38+T細(xì)胞百分比有差異（p<0.05）。IL-15作用下HAART組與HAART-na?ve組六種細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。兩者共同作用下，HAART組與HAART-na?ve組六種細(xì)胞百分比比較，只有CD8-IFN-γ細(xì)胞百分比有差異（p<0.05）。
　　2、不同刺激條件下，HAART及HAART-na?ve組組內(nèi)及組間HIV-1特異性T淋巴細(xì)胞的增殖情

12、況比較
　　HIV-1特異性抗原刺激的條件下，在HAART組中：IL-10R阻斷劑促進(jìn)CD4+T及CD8+T增殖較單純P24抗原表位刺激差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）, IL-15作用條件下能有效促進(jìn)CD4+T及CD8+T淋巴細(xì)胞增殖（p<0.05），兩者共同作用情況下，CD8+T增殖較單純 P24抗原表位刺激差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。在HAART-na?ve組:IL-10R阻斷劑促進(jìn)CD4+T及CD8+T增殖較單純P2

13、4抗原表位刺激差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）, IL-15作用條件下能有效促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞增殖（p<0.05），兩者共同作用下CD4+T、CD8+T增殖較單純P24抗原表位刺激差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。IL-10R阻斷劑作用條件下CD4+T及CD8+T細(xì)胞增殖在HAART組與HAART-na?ve間差異不顯著（p>0.05）；IL-15作用條件下CD4+T及CD8+T細(xì)胞增殖HAART組強(qiáng)于HAART-na?ve組（P<

14、0.05）；兩者共同作用情況下，兩組間CD4+T細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），而CD8+T細(xì)胞增殖HAART組強(qiáng)于HAART-na?ve組（P<0.05）。在HAART組中，CD4+T細(xì)胞增殖與IL-10R阻斷劑作用相關(guān)（rs=0.195，p=0.021），CD8+T細(xì)胞增殖與IL-15相關(guān)（rs=0.717，p<0.05）。在HAART-na?ve組中，CD4+T及CD8+T細(xì)胞增殖均與 IL-15相關(guān)（rs=0.341，

15、p p<0.05；rs=0.876, p<0.05）。無論 HAART組還是HAART-na?ve組，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖與CD4+T計數(shù)、CD8+T計數(shù)、Th/Ts及HIV-1病毒載量均無明顯相關(guān)性（p>0.05）。
　　3、不同刺激條件下，HAART組及 HAART-na?ve組組間及組內(nèi)的 HIV-1特異性CTL應(yīng)答比較
　　HIV-1特異性抗原刺激的條件下，外源性IL-15、IL-10R阻斷劑及兩者共同

16、作用下刺激HAART組及HAART-na?ve組HIV/AIDS感染者淋巴細(xì)胞后HIV-1抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答頻率均顯著高于單純 P24抗原表位刺激（p<0.05）；外源性 IL-15刺激后抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答頻率顯著高于 IL-10R阻斷劑作用（p<0.05）。外源性IL-15刺激HIV/AIDS感染者淋巴細(xì)胞抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答頻率HAART組明顯高于HAART-na?ve組（p<0.05），IL-10R阻斷劑及兩者共同作用情

17、況下HAART組及HAART-na?ve組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、外源性IL-15在體外能促進(jìn)HIV/AIDS感染者T淋巴細(xì)胞的活化、增殖、IFN-γ的釋放，記憶性T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其HIV-1抗原特異性CTL應(yīng)答；外源性IL-10受體阻斷劑對上述方面提升作用不顯著。
　　2、IL-15促進(jìn)HIV/AIDS感染者T淋巴細(xì)胞增殖及CTL應(yīng)答，接受HAART強(qiáng)于未接受HAART，細(xì)胞內(nèi)IFN

18、-γ、細(xì)胞活化、記憶性T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化不受抗病毒與否的影響；IL-10R阻斷劑作用促進(jìn)細(xì)胞活化未接受HAART強(qiáng)于HAART，而T淋巴細(xì)胞增殖、CTL應(yīng)答、細(xì)胞內(nèi)IFN-γ及記憶性T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化不受抗病毒與否的影響。
　　第二部分 IL-15對HIV-1感染者PBMCs病毒庫容量的影響
　　目的：評估IL-15對病毒庫的影響，為臨床提供減小病毒庫容量可能的基礎(chǔ)理論支持。
　　方法：以廣州市第八人民醫(yī)院感染科就診的HI

19、V-1感染者為研究對象（22例已接受HARRT，23例未經(jīng)HARRT），以HIV-1 P24編碼區(qū)的氨基酸序列人工合成的12個肽段組成的肽段庫作為HIV-1特異性抗原表位,以外源性細(xì)胞因子IL-15分別對HARRT-na?ve及HAART情況下的HIV-1 PBMCs刺激培養(yǎng)，72小時候收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞并利用磁珠分選技術(shù)分選培養(yǎng)后細(xì)胞，提取IL-15刺激前后分選細(xì)胞的核酸并使用熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)Total HIV-1 DNA

20、量；檢測培養(yǎng)上清中HIV-1 RNA病毒載量,全血中CD4+T，CD8+T細(xì)胞計數(shù)。對上述已接受HARRT與未經(jīng)HARRT的兩組病例的所有結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析比較。
　　結(jié)果:
　　1、無論有無接受抗病毒治療，HIV-1 DNA存在于所有的CD4+T細(xì)胞中，并且作為主要的病毒儲存庫存在；接受抗病毒治療能有效減少外周血中病毒儲存庫容量(P<0.05)。
　　2、IL-15能夠有效活化刺激病毒潛伏細(xì)胞釋放出病毒，并且導(dǎo)致釋放的

21、HIV-RNA載量在未經(jīng)抗病毒治療情況下更高。
　　3、IL-15能有效減少未經(jīng)抗病毒治療情況下CD4+T細(xì)胞內(nèi)HIV-DNA(P<0.05)。
　　4、在HAART-na?ve組IL-15刺激培養(yǎng)細(xì)胞釋放的HIV-1 RNA病毒載量與血清中病毒載量正相關(guān)（p<0.05），CD4+T細(xì)胞Total HIV-1 DNA與CD4+T細(xì)胞計數(shù)和CD4+T/CD8+T比值負(fù)相關(guān)（p<0.05），與血清病毒載量正相關(guān)（p<0.05）與