中國HIV-1感染者外周血細胞病毒庫在HAART中的變化及其與細胞因子的關(guān)系.pdf

1、高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy, HAART)的廣泛應(yīng)用使得人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus HIV)感染所致艾滋病(Acquied immunodeficiency symdrom，AIDS)的病死率及傳染率明顯下降。HAART治療不僅可以有效抑制人類免疫缺陷病毒的復(fù)制，降低艾滋病患者血清中的病毒載量至現(xiàn)有檢測方法測不出的水平，還能

2、升高CD4+T細胞水平，重建HIV-AIDS患者的免疫功能。然而，單純的HAART治療無法徹底治愈HIV感染。一旦停止HAART，便會出現(xiàn)病毒反彈，這就使得IV-AIDS需要終身堅持HAART治療，但是長期使用抗病毒藥物會出現(xiàn)一些問題:例如藥物毒副作用、依從性差、耐藥以及沉重的經(jīng)濟負擔。HIV感染者不能根治的關(guān)鍵是HIV病毒儲存庫的持續(xù)存在。
　　 HIV的病毒儲存庫包括某些細胞和組織器官。細胞儲存庫主要有CD4+淋巴細胞、單核

3、細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞，還可能有NK細胞和CD8+T細胞等，有報告認為CD4/CD8雙陽性T細胞以及CD4/CD8雙陰性T細胞都可能潛伏HIVDNA。國外關(guān)于CD4+T淋巴細胞以及外周血單個核細胞(PBMC)作為HIV-1儲存庫的研究較多，但是對于外周血T淋巴細胞以及單核細胞內(nèi)HIV-1前病毒DNA的長期追蹤研究不多見，對NK細胞內(nèi)是否存在潛伏感染的HIV前病毒DNA更是有爭議。目前我國的同類研究報告少見。本研究對15例接受HAAR

4、T治療4-7年的AIDS患者進行外周血NK細胞、T淋巴細胞以及單核細胞內(nèi)HIV-1前病毒DNA的檢測，發(fā)現(xiàn)這些患者這三種細胞內(nèi)仍有不同程度的HIV-1潛伏感染。本研究還通過前瞻性研究方法，觀察40例接受24月HAART治療的HIV/AIDS患者外周血NK細胞、T淋巴細胞以及單核細胞內(nèi)HIV-1前病毒DNA的動態(tài)變化情況，分析其與CD4+T細胞計數(shù)、外周血HIV-1 RN水平、Th1(Helper T lymphocyte1，輔助T淋巴細

5、胞1)細胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2細胞因子(IL-4、IL-10)以及L-15的關(guān)系，觀察抗病毒治療對三種外周血細胞內(nèi)HIV病毒儲存庫的影響，以及淋巴因子在抗病毒免疫重建中可能扮演的角色;探索在血清HIV-1RNA低于檢測下限時HIV-1前病毒NA作為判斷抗病毒治療療效以及病情進展預(yù)測新指標的價值，并為日后進一步探索徹底清除HIV病毒的新治療措施奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究包括以下兩部分:
　　 第一部分中國HI

6、V-AIDS外周血細胞病毒儲存庫在HAART中的動態(tài)變化
　　 目的:本研究擬了解NK細胞是否是HIV-1病毒的儲存庫細胞之一，并對中國HIV-1感染者兩年HAART治療過程中外周血NK細胞、T淋巴細胞以及單核細胞中HIV-1DNA水平的變化進行前瞻性的動態(tài)觀察，對其與主要的免疫學指標（外周血CD4+T細胞計數(shù)）和病毒學指標(血漿HIV-1RNA)的關(guān)系進行分析，觀察抗病毒治療對三種血細胞內(nèi)HIV病毒儲存庫的影響，并觀察在血清H

7、IV-1RNA低于檢測下限時，HIV-1前病毒對于判斷抗病毒治療療效以及預(yù)測病情進展的意義。
　　 方法:對15例接受HAART治療4-7年的患者采集血標本進行橫斷面研究。對40例未接受HAART治療的HIV/AIDS患者在啟動HAART治療后進行為期兩年的隨訪觀察，在HAART基線（0月）、啟動治療后6月、12月、18月及24月五個時間點采集患者的血標本。使用磁珠分選法從外周血單個核細胞(PBMC)中分離出T淋巴細胞、單核細胞

8、和NK細胞，通過HIV實時熒光定量PCR檢測外周血HIV-1 RNA病毒載量，NK細胞、單核細胞和T淋巴細胞內(nèi)的HIV-1 DNA水平，流式細胞術(shù)檢測外周CD4+T細胞數(shù)量，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理及相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:15名接受4-7年（平均62.45±13.53月）HAART治療的HIV/AIDS患者外周血HIV-1RNA均低于檢測下限(＜50拷貝/ml即＜1.69l0g拷貝/ml); T淋巴細胞中HIV-1前病毒DNA的

9、平均含量2.03±0.48(log拷貝/106個細胞);NK細胞中HIV-1前病毒DNA均值為1.82±0.32(log拷貝/106個細胞);單核細胞中HIV-1前病毒DNA均值為1.75±0.19(log拷貝/106個細胞);3種細胞中HIV-1 DNA陽性者比例分別為6/15、4/15、2/15。40例隨訪患者在HAART治療啟動后0月，6月，12月，18月及24月的CD4+T細胞計數(shù)（X±SD）分別為194.98±95.25個/μ

10、l，325.68±99.38個/μl，387.36±133.94個/μl，433.38±136.72個/μl，483.58±133.86個/μl，血清中HIV-1RNA log值的平均水平(X±SD)分別為4.35±1.15，1.76±0.46，1.75±0.32，1.97+1.03，＜1.69(log拷貝/ml)。統(tǒng)計學分析顯示:外周血HIV-1 RNA水平和CD4+T細胞計數(shù)呈負相關(guān)。在HAART治療0月，6月，12月，18月及24

11、月，NK細胞中HIV-1前病毒DNA平均log值為3.40±0.79，2.51±0.53，2.40±0.43，2.18±0.42，2.02±0.42(log拷貝/106個細胞);T淋巴細胞中HIV-1前病毒DNA平均log值為3.71±0.67，2.99±0.51，2.49±0.42，2.23±0.48，2.11±0.36(log拷貝/106個細胞);單核細胞中HIV-1前病毒DNA平均log值為2.92±0.78，2.04±0.29，

12、2.03±0.22，2.01±0.27，1.97±0.1(log拷貝/106個細胞）。隨著HAART治療的進行，三種細胞中的平均HIV-1 DNA載量均呈下降趨勢，與血清RNA載量的下降和CD4計數(shù)的上升趨勢一致。且在治療啟動后的前12個月下降比較明顯。統(tǒng)計學分析顯示:在HAART治療過程中，外周血T淋巴細胞與NK細胞中的HIV-1 DNA水平與外周血HIV RNA水平之間都呈正相關(guān)關(guān)系，與外周血CD4+T細胞計數(shù)均呈負相關(guān)關(guān)系;而單核

13、細胞內(nèi)HIV-1DNA雖然與外周血HIV RNA水平呈正相關(guān)關(guān)系但與CD4+T細胞的關(guān)系不明顯。NK細胞中與T淋巴細胞中HIV-1 DNA水平在HAART治療不同時期均呈顯著正相關(guān)，NK細胞中與單核中HIV-1 DNA水平在HAART治療不同時期呈正相關(guān)或無相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論:
　　 1、發(fā)現(xiàn)中國HIV-1感染者外周血中除了T淋巴細胞和單核細胞外，CD3-CD56+NK細胞也可能是HIV-1的病毒儲存庫之一。在長期H

14、AART治療(4-7年)后，盡管表現(xiàn)出明顯的抗病毒效果和免疫重建效果,仍然不能徹底清除CD3-CD56+NK細胞、CD3+T淋巴細胞和CD14+單核細胞中的HIV-1前病毒DNA。
　　 2、前瞻性觀察到在兩年HAART治療中，外周血HIV-1 RNA水平明顯下降，CD4+T細胞數(shù)量明顯上升，二者呈顯著的負相關(guān)關(guān)系;隨著外周血HIV-1 RNA水平降低，T淋巴細胞以及CD3-CD56+NK細胞中的HIV-1 DNA也逐步減少;二

15、者呈顯著的正相關(guān)關(guān)系;同時，外周血CD4+T細胞計數(shù)與這兩種細胞中的HIV-1DNA的水平呈負相關(guān)關(guān)系，提示HIV-1前病毒DNA的檢測對于抗病毒治療療效的判斷以及病情進展的預(yù)測都有著重要的意義。
　　 3、隨著HAART治療的進行，外周血T淋巴細胞、單核細胞和NK細胞中HIV DNA水平均逐步減少，但是T淋巴細胞中的下降速度最慢，提示T淋巴細胞可能是HIV病毒最主要的細胞儲存庫。
　　 第二部分中國HIV-AIDS在H

16、AART中外周血細胞病毒儲存庫與細胞因子的關(guān)系
　　 目的:本研究通過觀察在兩年HAART治療過程中，外周血細胞HIV病毒儲存庫(NK細胞、T淋巴細胞及單核細胞內(nèi)的HIV-1 DNA)與Th1細胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2細胞因子(IL-4、IL-10)以及IL-15的關(guān)系，以期進一步探索這些細胞因子在免疫治療清除HIV-1病毒儲存庫中的作用。
　　 方法:對40例初次接受HAART治療的HIV/AIDS進行為

17、期兩年的隨訪觀察，在HAART基線、啟動治療后6月、12月、18月及24月五個時間點采集患者的血標本。使用磁珠分選法從外周血單個核細胞(PBMC)中分離出T淋巴細胞、單核細胞和NK細胞，通過HIV實時熒光定量PCR檢測外周血HIV-1 RNA病毒載量、NK細胞、單核細胞和T淋巴細胞內(nèi)的HIV-1 DNA水平，流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞數(shù)量，ELISA法測定血漿Th1細胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2細胞因子(IL-4、IL-10

18、)以及IL-15的濃度。同時對40例正常人血清中的Th1細胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2細胞因子(IL-4、IL-10)以及IL-15的濃度進行檢測。并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理及相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:40例患者在HAART啟動的0月、6月、12月、18月和24月各時間點，血漿中Th1細胞因子(IL-2和IFN-)濃度呈逐漸升高趨勢，Th2細胞因子(IL-4和IL-10)濃度呈下降趨勢，IL-15濃度呈升高趨勢。IFN-γ

19、、IL-4與IL-10在各個治療時間點與外周血CD4+T細胞計數(shù)及血漿HIV-1 RNA均無明顯相關(guān)性。IL-2及IL-15與外周血CD4+T細胞計數(shù)在各個治療時間點均呈正相關(guān)關(guān)系(IL-2與外周血CD4+T細胞計數(shù):0月r=0.36，P=0.02;6月r=0.36，P=0.02;12月r=0.48，P=0.001;18月r=0.60，P＜0.001;24月r=0.68，P=0.001; IL-15與外周血CD4+T細胞計數(shù):P值均＜0

20、.001，0月r=0.52;6月r=0.81;12月r=0.63;18月r=0.68;24月r=0.66）。IL-2及IL-15濃度與外周血HIV-1 RNA載量均呈負相關(guān)關(guān)系（0月時IL-2:r=0.33，P=0.04;IL-15:r=0.34，P=0.03;6月以后絕大多數(shù)病例外周血HIV-1 RNA載量低于檢測下限，故無相關(guān)性檢測）。IL-2與T淋巴細胞內(nèi)的HIV-1 DNA有負相關(guān)關(guān)系（0月r=0.35，P=0.03;6月r=0

21、.49，P=0.001;12月r=0.32，P=0.04;18月r=0.49，P=0.001，;24月r=0.41，P=0.01），與NK及單核細胞內(nèi)的HIV-1 DNA無明顯相關(guān); IL-15與T淋巴細胞（6月r=-0.49，P=0.003;24月r=0.54，P＜0.001）及NK細胞（6月r=0.67，P＜0.001;12月r=0.57，P＜0.001;24月r=0.51，P＜0.001）內(nèi)的HIV-1 DNA水平負相關(guān)，與單核細

22、胞內(nèi)的HIV-1 DNA無明顯相關(guān);而IFN-γ、IL-4和IL-10濃度與三種細胞內(nèi)的HIV-1DNA水平均無明顯相關(guān)性。
　　 將40例患者按照外周血T淋巴細胞內(nèi)HIV-1 DNA載量的下降速度分組，具體為按其在HAART治療24月HIV DNA載量是否低于檢測下限分為A組（低于檢測下限組）和B組（未低于檢測下限組），并對兩組患者進行t檢驗后發(fā)現(xiàn)，在HAART治療基線，這兩組患者的IL-2水平無差異，而經(jīng)過HAART治療后，

23、在6月、12月、18月及24月，兩組患者的IL-2水平差異有統(tǒng)計學意義;T淋巴細胞內(nèi)HIV-1 DNA載量24月檢測不到的患者IL-2水平普遍高于24月HIV-1 DNA持續(xù)存在的患者。而對IL-15的t檢驗發(fā)現(xiàn)，在HAART基線、6月、12月、18月及24月，T淋巴細胞內(nèi)HIV-1 DNA載量24月檢測不到的患者IL-15水平均高于24月HIV-1 DNA持續(xù)存在的患者。
　　 結(jié)論:
　　 1、HAART治療開始后各

24、時間點，Th1細胞因子IL-2、IFN-r濃度和IL-15濃度逐漸上升，Th2細胞因子IL-4、IL-10濃度逐漸下降。IL-2及IL-15水平與CD4+T淋巴細胞數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，與外周血HIV-RNA水平呈負相關(guān)關(guān)系，提示IL-2及IL-15可能與CD4+T淋巴細胞的增殖以及免疫重建相關(guān)。
　　 2、外周血T淋巴細胞內(nèi)的HIV-1 DNA載量與IL-2水平呈負相關(guān)，而且T淋巴細胞內(nèi)的HIV-1 DNA載量下降得快的患者血漿中