超聲清創(chuàng)結(jié)合聚己雙胍治療早期局限骨感染的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　戰(zhàn)創(chuàng)傷等高能量損傷常造成嚴重開放性骨折并易繼發(fā)感染。早期清創(chuàng)是治療的關(guān)鍵，也是后續(xù)其他治療的基礎(chǔ)。目前臨床最常見清創(chuàng)技術(shù)即銳性手術(shù)切除結(jié)合鹽水沖洗或者碘伏消毒液和雙氧水沖洗，沿用多年。對于傷后細菌沾染效果較好，但對于細菌已經(jīng)定植并已經(jīng)形成感染的情況，在能否有效減少組織中的細菌載荷方面，效果值得懷疑。近年來創(chuàng)面的清創(chuàng)的有了一些新的器械和方法，如高壓脈沖沖洗、低壓脈沖沖洗、以及Versajet水刀系統(tǒng)等等。而脈沖沖洗對

2、于組織的損傷也是不可忽視的，Versajet水刀系統(tǒng)更適用于創(chuàng)面的清創(chuàng)，目前對于清創(chuàng)術(shù)中是否需應(yīng)用低毒性的消毒劑尚有爭議。低頻超聲波作為一種獨特的能量釋放方式（空化效應(yīng)）也已經(jīng)用在各種急性創(chuàng)傷和慢性感染創(chuàng)面的治療中，其清除作用的機理以及能否直接殺菌目前還不十分清除。需要進行研究驗證。
　　研究目的:
　　1、明確低頻超聲與聚己雙胍(PHMB)在清除和殺滅體外浮游態(tài)和生物膜態(tài)金葡菌單獨和協(xié)同效應(yīng);
　　2、設(shè)計建立全新可

3、靠的脛骨局限性骨感染兔動物模型;
　　3、檢驗超聲清創(chuàng)聯(lián)合PHMB對金葡菌接種后48小時兔骨感染模型的治療效果。
　　研究方法:
　　實驗1.
　　(1)將金黃色葡萄球菌接種于LB培養(yǎng)基中，形成含有浮游菌的菌液，給與不同時間梯度（0秒、5秒、10秒、20秒、30秒、60秒、120秒、300秒、600秒）的低頻超聲暴露后，行細菌涂板計數(shù)和液體培養(yǎng)混濁度定性觀察評估。
　　(2)向含有金黃色葡萄球菌的LB培養(yǎng)基

4、中加入由20％PHMB溶液經(jīng)不同比例稀釋的PHMB溶液(1∶100、1∶200、1∶500、1∶100、1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000、1∶20000、PBS液)，作用1小時后，行細菌的定量檢測。
　　(3)將LB培養(yǎng)基中的浮游態(tài)金黃色葡萄球菌接受30秒低頻超聲作用，再與由20％PHMB溶液經(jīng)不同比例稀釋的溶液(1∶100、1∶200、1∶500、1∶100、1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶

5、10000、1∶20000、PBS液)作用，檢測不同濃度梯度下的細菌剩余量和定性評估。
　　(4)在接種有金葡菌的培養(yǎng)孔板底部通過隔日換液培養(yǎng)形成金葡菌生物膜。然后使其接受由20％PHMB溶液經(jīng)不同比例稀釋的PHMB溶液(空白對照、1∶5000、1∶2000、1∶1000、1∶500、1∶200、1∶100、1∶10)處理。再對各處理組進行細菌定量測定。
　　(5)在接種有金葡菌的培養(yǎng)孔板底部通過隔日換液培養(yǎng)形成金葡菌生物膜

6、。細菌生物膜接受30秒超聲輻照與由20％PHMB溶液經(jīng)不同比例稀釋的PHMB溶液（空白對照、1∶5000、1∶2000、1∶1000、1∶500、1∶200、1∶100、1∶10）作用后進行細菌計數(shù)。
　　(6)在接種有金葡菌的培養(yǎng)孔板底部通過隔日換液培養(yǎng)形成金葡菌生物膜。將孔分成4組，每組9個。分別行PBS液沖洗，30秒超聲作用，0.05％PHMB作用以及30秒超聲聯(lián)合0.05％PHMB作用后，行結(jié)晶紫染色。測定結(jié)晶紫染色后數(shù)碼

7、照片的灰度值，并在各組之間進行比較。
　　實驗2
　　(1)配制金葡菌接種菌液。采用麥氏比濁法制備log10(CFU/ml)為8的細菌生理鹽水懸液作為浮游菌接種液。
　　(2)將兔骨塊置入含有金葡菌的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時形成載菌骨。涂板法測定每塊載菌骨含菌量為log10（CFU/塊）為6.9±0.5。
　　(3)實驗動物分成2組，每組10只，A組以菌液接種，B組以載菌骨接種，觀察兩種動物模型的感染成功率，病死

8、率，體溫和CRP反應(yīng)特點，局部創(chuàng)口愈合情況，以及X片的表現(xiàn)和病理切片檢查。
　　實驗3
　　(1)將兔骨塊置入含有金葡菌的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時形成載菌骨。
　　(2)50只雄性新西蘭白兔，完全隨機法分成5組。所有動物于右脛骨近端鉆孔接種載菌骨，術(shù)后48小時后按分組進行清創(chuàng)。
　　(3)NaCl組行清創(chuàng)后生理鹽水沖洗;US組，清創(chuàng)后采用低頻超聲波結(jié)合生理鹽水沖洗;PHMB組為清創(chuàng)后性0.1％PHMB溶液輕柔沖洗

9、，US+PHMB組為清創(chuàng)后采用低頻超聲波結(jié)合0.1％PHMB聯(lián)合沖洗。碘伏組為清創(chuàng)后應(yīng)用0.1％稀釋碘伏溶液沖洗。
　　(4)觀察指標為術(shù)后動物的體溫、體重、術(shù)后6周時局部創(chuàng)口外觀評分，X線評分，以及病理評分進行組間比較。
　　結(jié)果:
　　實驗1
　　(1)浮游態(tài)細菌在不同低頻超聲暴露時間后，細菌計數(shù)變化不顯著。
　　(2)對于浮游態(tài)細菌由20％PHMB經(jīng)不同倍數(shù)稀釋的溶液作用，細菌的減少量呈現(xiàn)出明顯的濃度

10、依賴性，于1/200稀釋組（濃度為0.1％），實現(xiàn)了全部殺菌。
　　(3)對于浮游表型的金葡菌，不同稀釋倍數(shù)的PHMB結(jié)合超聲殺菌后的定量檢測發(fā)現(xiàn)，殺菌效能仍然隨著濃度的升高而增強，但是僅在20％PHMB溶液稀釋2000倍（濃度為0.01％）時就可以將細菌全部殺滅。
　　(4)孔板對于0.04％PHMB與超聲處理單獨處理后，結(jié)晶紫染色后灰度值都有升高，聯(lián)合處理后更明顯。經(jīng)方差分析，0.04％PHMB與超聲處理之間存在協(xié)同效應(yīng)

11、。
　　實驗2
　　(1)涂板法測定每塊載菌骨含菌量為log10（CFU/塊）為6.9±0.5。
　　(2)A組動物，術(shù)后體溫波動較B組動物更大，而且有3只死亡，而B組動物在4周觀察時間內(nèi)都有存活。AB兩組動物體重變化不大。A組動物中成功形成骨髓炎5只，B組成功形成骨髓炎10只。A組X線表現(xiàn)為髓內(nèi)型，而B組X線表現(xiàn)為局部型。A組動物CRP檢測波動大于B組動物。兩組動物病理學檢查都成典型骨髓炎表現(xiàn)。細菌培養(yǎng)A組存活動物7

12、只中2只陰性，5只陽性。B組存活動物10只，均陽性。
　　實驗3
　　所有接種載菌骨動物術(shù)后48小時均存活，局部出現(xiàn)紅腫滲出。
　　NaCl組、PHMB組、PHMB+US組、碘伏組、動物均有1只在第6周實驗終點前死亡，而US組有2只死亡。各組動物術(shù)后體溫變化、體重變化差異沒有統(tǒng)計學意義。PHMB+US組在局部創(chuàng)面評分、X片表現(xiàn)視覺評分以及病理評分，都優(yōu)于其他各組，而其他各組之間差異不顯著。
　　結(jié)論:
　　

13、1、低頻超聲本身對于體外金黃色葡萄球菌的幾乎沒有殺菌作用。
　　2、PHMB可殺滅體外浮游態(tài)與生物膜態(tài)金葡菌。藥物濃度越高，殺菌效果越好。生物膜態(tài)金葡菌對于PHMB具有更強耐藥性。
　　3、無論對于浮游態(tài)細菌還是生物膜態(tài)細菌，PHMB與低頻超聲在殺滅細菌作用上都存在協(xié)同，但生物膜態(tài)細菌仍然難以完全殺滅。
　　4、采用載菌骨植入法可建立兔局限性骨髓炎模型。該模型具有建模成功率高，全身反應(yīng)輕，死亡率低的優(yōu)點?？梢阅M人類外