雙膦酸鹽結合BMSCs治療椎體骨質疏松的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠骨髓間充質干細胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定和標記
　　目的：
　　通過體外分離、培養(yǎng)、擴增、誘導BMSCs，研究BMSCs的生物學特性和形態(tài)學特征。用熒光標記BMSCs，通過描繪、對比其生長曲線來比較熒光染料對BMSCs細胞活性的影響。
　　方法：
　　1.無菌條件下取大鼠的股骨和脛骨，用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化BMSCs。待細胞鋪滿瓶底90％左右，1:2進行傳代。
　　2.用流式細胞儀檢測貼壁細

2、胞表面抗原，鑒定是否為目的細胞。
　　3.選取生長狀態(tài)良好的P3代細胞，成骨誘導21天，行茜素紅和von Kossa改良染色法，觀察其產生鈣結節(jié)能力。
　　4.用CM-Dil標記BMSCs，觀察其標記能力。通過計數和對比非標記細胞的數目，并繪制生長曲線，明確CM-Dil對BMSCs增殖能力影響。
　　結果：
　　1.SD大鼠骨髓細胞全貼壁培養(yǎng)24h后部分貼壁，呈大小不能的球形；48h后大部分細胞貼壁，呈紡錘形或星

3、形；6-7d后可以進行首次傳代。
　　2.所培養(yǎng)的貼壁細胞99%以上表達 CD29，CD44和CD90，不表達CD34，CD45。證明所培養(yǎng)的細胞為BMSCs。
　　3.茜素紅染色可見礦化結節(jié)呈紅色，Von Kossa改良染色法光鏡下可見被染成紅色的細胞團塊中間有粗大的黑色結節(jié)。證明間充質干細胞確實被誘導成了成骨細胞并且有鈣結節(jié)產生。
　　4. CM-Dil對BMSCs的即時標記率為100%，通過觀察、計數、對比其細胞

4、形態(tài)和細胞數目，發(fā)現并無明顯差別。
　　結論：
　　1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法能獲得理想的BMSCs。
　　2.BMSCs經誘導后有產生鈣結節(jié)的能力。
　　3.CM-Dil能夠有效的標記BMSCs,且不會影響其生物學性質，是體外示蹤的有效方法。
　　第二部分大鼠骨質疏松模型的建立
　　目的：
　　有效建立大鼠椎體骨質疏松模型并鑒定是否骨質疏松。
　　方法：
　　1.雌性大鼠雙側卵巢切除術。

5、
　　2.通過觀察大鼠陰道分泌物涂片，確認是否切除卵巢成功。
　　結果：
　　切除卵巢的大鼠不再有性動周期，連續(xù)一周的陰道分泌物涂片均停留在動情間期。
　　結論：
　　1.通過去除大鼠雙側卵巢建立骨質疏松模型的方法是可行的。
　　2.通過連續(xù)觀察大鼠陰道分泌物涂片能夠判斷大鼠去勢成功。
　　第三部分骨髓間充質干細胞聯合雙膦酸鹽治療骨質疏松椎體的實驗研究
　　目的：
　　在前期建立椎體

6、骨質疏松模型基礎上，給予大鼠相應椎體移植不同濃度BMSCs以及雙膦酸鹽治療，通過測量相關指標，判斷其療效。
　　方法：
　　1.12周齡未交配過的雌性大鼠100只，隨機分為5組，每組20只。①對照組；②去勢組；③去勢+移植組；④去勢+雙膦酸鹽組；⑤去勢+移植+雙膦酸鹽組。
　　2.采用切除雙側卵巢的方法構建骨質疏松模型。去勢12周后，將CM-Dil標記的P3代BMSCs，用1ml注射器以5×104/ml、5×105/m

7、l、5×106/ml、5×107/ml、5×108/ml濃度的細胞懸液等體積分別注入③組和⑤組大鼠L2--L6的椎體，L1椎體注入等體積的熒光懸液。④組和⑤組大鼠給予阿侖膦酸鈉灌胃處理（8.2mg/kg），每周一次，連續(xù)12周。所有大鼠均在同一條件下喂養(yǎng)。
　　3.治療后12w分別處死相應組大鼠20只。
　　4.通過硬組織磨片機制作骨磨片，熒光顯微鏡觀察干細胞是否移植成功。
　　5.通過MicroCT測量相關的骨代謝指

8、標，判斷是否有療效。
　　結果：1.移植干細胞后12w制作骨組織磨片，熒光顯微鏡下觀察，能觀察到新生骨小梁中有紅色熒光發(fā)出。
　　2.將切除雙側卵巢的大鼠于12w后分別通過Micro-CT檢測，發(fā)現②組大鼠相比于①組大鼠其椎體BMD，Tb.N，Tb.Th，BV/TV是顯著下降的。BMD降低了37.86%（P＜0.05）；Tb.N降低了77.25%（P＜0.05）；Tb.Th降低了43.48%（P＜0.05）；BV/TV降低了

9、66.67%（P＜0.05）。
　　3.Micro-CT檢測發(fā)現，④組和②組相比，ALE治療能明顯改善大鼠椎體松質骨的骨微結構，BMD升高了16.19%（P＜0.05）；Tb.N升高了49.61%（P＜0.05）；Tb.Th升高了57.69%（P＜0.05）；BV/TV升高了55.56%（P＜0.05）。
　　4.Micro-CT檢測發(fā)現，③組大鼠L1與②組大鼠椎體骨微結構參數相差不大。隨著BMSCs移植濃度的升高，L2-L

10、6椎體呈現出BV/TV，Tb.Th，Tb.N，BMD
　　逐漸增加， BS/BV， Tb.Sp逐漸降低的趨勢。
　　5.Micro-CT檢測發(fā)現，⑤組和③組相比，L2-L6椎體骨密度均升高，L1椎體骨密度與④組骨密度接近，⑤組和①組相比，L6椎體骨密度接近，但前者依然低于后者。
　　結論：
　　1.熒光標記的干細胞椎體移植成功。
　　2.通過摘除大鼠雙側卵巢可成功建立骨質疏松模型，隨著時間延長，去勢大鼠的骨