CTCF蛋白介導(dǎo)的DNA相互作用構(gòu)建規(guī)律.pdf

1、真核生物基因組在增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和絕緣子等DNA元件的組織下，形成高度有序的結(jié)構(gòu)，輔助基因組實(shí)現(xiàn)復(fù)雜而精細(xì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。絕緣子結(jié)合蛋白CTCF（CCCTC-binding factor)在cohesin的輔助下特異性地介導(dǎo)基因組范圍內(nèi)的DNA相互作用。但是CTCF介導(dǎo)特異性相互作用的原因還不清楚。人或小鼠Pcdh基因簇包括超過50個(gè)基因，每個(gè)基因具有一個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子。通過啟動(dòng)子選擇，Pcdh基因簇能夠產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞表面的分子多樣性，這種多樣

2、性在神經(jīng)環(huán)路裝配以及大腦發(fā)育中具有至關(guān)重要的作用。近乎每個(gè)簇狀Pcdh基因啟動(dòng)子區(qū)域都具有一個(gè)潛在的CTCF結(jié)合位點(diǎn)（CTCF-binding site,CBS），因此CTCF蛋白可能參與簇狀Pcdh基因的啟動(dòng)子選擇。
　　在第二章中，通過序列分析和體外 EMSA實(shí)驗(yàn)，鑒定CTCF能夠直接結(jié)合于Pcdh基因的增強(qiáng)子和近乎所有的啟動(dòng)子區(qū)域。在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞中，下調(diào)CTCF的表達(dá)導(dǎo)致CTCF富集于啟動(dòng)子區(qū)域和增強(qiáng)子區(qū)

3、域的強(qiáng)度顯著降低，表明CTCF在體內(nèi)也能夠富集于Pcdh基因增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域。
　　在第三章中，通過ChIP-seq繪制了CTCF、Rad21（cohesin亞基）、H3K4me3、H3K27me3和RNAPII在SK-N-SH細(xì)胞中的富集圖譜，發(fā)現(xiàn)CTCF/cohesin僅富集在H3K4me3標(biāo)記的激活的Pcdh啟動(dòng)子區(qū)域，以及增強(qiáng)子區(qū)域。通過染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)3C-qPCR發(fā)現(xiàn)下游的增強(qiáng)子HS5-1和HS7同激活的但不能夠同

4、失活的Pcdhα啟動(dòng)子間形成長范圍的DNA相互作用，且下調(diào)CTCF或cohesin顯著降低這種相互作用。這些結(jié)果表明CTCF/cohesin介導(dǎo)的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子DNA相互作用參與了Pcdhα基因簇的啟動(dòng)子選擇。
　　在第四章中，通過染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)4C-seq和3C-qPCR鑒定了Pcdhγ調(diào)控區(qū)，并進(jìn)一步揭示Pcdh基因簇存在兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的調(diào)控單位，即Pcdhα和Pcdhβγ相互作用結(jié)構(gòu)域。令人吃驚的是，當(dāng)敲除Pcdhα基因簇

5、（大于250Kb）或同時(shí)敲除Pcdhα和β基因簇（大于550Kb）并未觀察到顯著的DNA結(jié)構(gòu)的改變。但有趣的是我們發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中，CTCF介導(dǎo)的相互作用總是傾向于在正-負(fù)向CBS之間建立（我們定義包含CCCTC核心序列的CBS為反向，而包含GAGGG的CBS為正向)。
　　在第五章中，通過CRISPR技術(shù)翻轉(zhuǎn)增強(qiáng)子HS5-1（包含2個(gè)CBS）導(dǎo)致HS5-1向相反的方向形成新的DNA相互作用，暗示CBS的方向可能決定其形成DN

6、A相互作用的方向。通過分析基因組范圍內(nèi)的ChIP-seq和ChIA-PET數(shù)據(jù)，我們驗(yàn)證了該假設(shè)。例如，在人K562細(xì)胞中，正-負(fù)向CBS形成的相互作用占所有CTCF介導(dǎo)相互作用的75％，負(fù)-正向CBS形成的相互作用的比例僅為2.6%。此外，我們正在多個(gè)單基因位置對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行了驗(yàn)證。在β-globin基因簇位置，我們通過CRISPR技術(shù)敲除CBS或翻轉(zhuǎn)CBS，預(yù)測可能引起的DNA結(jié)構(gòu)的改變，并通過4C-seq技術(shù)驗(yàn)證了預(yù)測的正確性。最后

7、，依據(jù)該規(guī)則，我們建立了一個(gè)CTCF介導(dǎo)的DNA相互作用構(gòu)建模型。我們推測當(dāng)負(fù)-正向CBS富集足夠程度的CTCF/cohesin時(shí)，負(fù)-正向CBS能夠形成CTCF介導(dǎo)的相互作用的邊界。不同邊界之間形成相對(duì)獨(dú)立的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域。在結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，正-負(fù)向CBS形成較強(qiáng)的相互作用，同向CBS形成較弱的相互作用。
　　因此，該研究不僅揭示CTCF/cohesin介導(dǎo)的DNA相互作用參與了Pcdh基因簇啟動(dòng)子的選擇性表達(dá)，為Pcdh基因簇選擇性表