狹葉南五味子內(nèi)生真菌三萜類次生代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌種類豐富多樣，它們的全部或部分生活階段在健康植物的各種組織和器官內(nèi)，對(duì)宿主不表現(xiàn)明顯病害。植物內(nèi)生真菌尤其是藥用植物的內(nèi)生菌由于其次生代謝產(chǎn)物種類豐富、結(jié)構(gòu)新穎、活性優(yōu)良，有一些甚至還能產(chǎn)生與宿主植物有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu)、功能相近的化合物而受到越來(lái)越多的關(guān)注。狹葉南五味子作為一味中國(guó)傳統(tǒng)中藥能夠活血化瘀促進(jìn)血液循環(huán)，主要用于治療骨折和月經(jīng)不調(diào)等疾病。天然產(chǎn)物研究表明五味子類植物主要的兩種成分是木質(zhì)素類和三萜類。其中，近年來(lái)從五味

2、子科植物中發(fā)現(xiàn)了一系列結(jié)構(gòu)新穎的萜類化合物，并且具有抗炎、抗腫瘤、抗HIV等多種藥學(xué)活性，這些研究成果都引起人們新的興趣。然而，目前對(duì)于五味子三萜類化合物的研究還不夠深入，并且對(duì)于狹葉南五味子內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)研究基本沒有。
　　基于此，本研究以團(tuán)隊(duì)前期分得的狹葉南五味子內(nèi)生真菌為研究對(duì)象，利用色譜篩選方法尋找可以產(chǎn)生五味子代表活性三萜——尼哥納樂酸(nigranoic acid)的內(nèi)生真菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)分子學(xué)的鑒定。

3、其次，選用一株前期篩選出的可以轉(zhuǎn)化狹葉南五味子的內(nèi)生真菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，利用一系列的色譜分離手段，對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究分析，再結(jié)合各種波譜數(shù)據(jù)，解析化合物結(jié)構(gòu)，以獲得一系列新穎的五味子三萜類化合物。該項(xiàng)研究通過分析代謝產(chǎn)物的不同來(lái)探究?jī)?nèi)生真菌與植物的關(guān)系，以及其在植物本身代謝中的作用。同時(shí)研究得到的結(jié)構(gòu)新穎的化合物，可以為進(jìn)一步的活性研究以及內(nèi)生真菌資源的利用提供理論基礎(chǔ)。
　　研究具體結(jié)果如下：
　　實(shí)驗(yàn)室在前期的工作中已

4、經(jīng)從狹葉南五味子的根莖部分得到了293株內(nèi)生真菌，初步歸屬于22個(gè)屬。采用改良液體培養(yǎng)基(PDB)讓這些菌分別進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃取，得到發(fā)酵粗產(chǎn)物。以nigranoic acid為標(biāo)準(zhǔn)品，利用薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)技術(shù)對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，從中篩選到了一株保藏名為 SWUKD3.1601的菌株可能有產(chǎn)nigranoic acid的能力。根據(jù)菌株的宏觀顯微形態(tài)，同時(shí)結(jié)合分子生物學(xué)的鑒定方法(以ITSl和I

5、TS4為引物，對(duì)ITS序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，建樹)鑒定目標(biāo)菌株為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。哈茨木霉在以往的研究中主要是作為生物防治菌，常被用來(lái)預(yù)防由病原菌引起的植物病害。這個(gè)研究也提供了一個(gè)依靠發(fā)酵獲得nigranoic acid的方法，為解決植物資源有限的問題提供新途徑。
　　另外，篩選出一株具有顯著催化活性并且次生代謝產(chǎn)物豐富的內(nèi)生真菌，鑒定為青霉菌(Penicillium

6、 ochrochloron SWUKD4.1850)。以狹葉南五味子藤莖部分作為固體培養(yǎng)基，接種該菌進(jìn)行大量發(fā)酵。用丙酮浸提得到次生代謝的粗產(chǎn)物。采用常規(guī)的分離技術(shù)：以薄層色譜(TLC)示蹤，運(yùn)用硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、制備薄層層析以及重結(jié)晶等分離手段對(duì)代謝產(chǎn)物分離純化，得到的單體化合物利用各種現(xiàn)代波譜技術(shù)(UV、IR、旋光、EI-MS、HR-ESI-MS、1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H

7、COSY、HSQC、HMBC、ROESY、X單晶衍射等)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析鑒定，最終確定得到了12個(gè)五味子三萜化合物。其中wuweizidilactone Q(1)。henrischinins D-I(2-7)為7個(gè)新發(fā)現(xiàn)的化合物，henrischinin A(8)。henrischinin B(9)。schirubridilactone D(10)。wuweizidilactone D(11)。lancifodilactone D(12)為

8、5個(gè)已知的五味子三萜。這些五味子三萜根據(jù)結(jié)構(gòu)特征主要?dú)w屬于18-Norschiartane-type，(21,24-Cyclo)-3,4;9,10-seco-cycloartane-type，Schisanartane-type，18(13,14)-abeo-Schiartane-type四個(gè)大類。其中已知的化合物henrischinin A-B被報(bào)道具有抗HSV-2(EC50=0.24mg/mL)活性，對(duì)癌細(xì)胞有毒性(HL-60 IC

9、50=16.5,10.5μM)。schirubridilactone D具有抗HIV-1活性(EC50=80.8 mg/mL)。與五味子本身就含有的五味子三萜相比，內(nèi)生真菌共發(fā)酵得到的三萜的氧化度普遍較高，推測(cè)可能是微生物對(duì)宿主的化學(xué)成分進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，說明五味子萜類的生成可能與植物內(nèi)內(nèi)生真菌的存在和參與有關(guān)。
　　本工作通過對(duì)狹葉南五味子內(nèi)生真菌三萜類次生代謝產(chǎn)物的研究，發(fā)現(xiàn)了特殊的菌株和一些結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物，預(yù)示了植物內(nèi)生真