狹葉南五味子內(nèi)生真菌多樣性及其發(fā)酵研究.pdf

1、狹葉南五味子隸屬于五味子科，多年生常綠木質(zhì)藤本植物，為云南省珍貴的民間藥材，其藤莖具有活血化瘀、行氣止痛的作用，民間多用于治療骨折以及月經(jīng)不調(diào)。前人對(duì)狹葉南五味子化學(xué)成分的研究表明，其含有的木脂素類以及三萜類化合物具有抗肝炎、抗氧化、抗腫瘤和抗HIV等多種藥理活性。作為一味云南民間的傳統(tǒng)藥材，至今還沒有報(bào)道關(guān)于其內(nèi)生真菌的研究。內(nèi)生真菌是指在生活史的一定階段或者全部階段生活在健康植物組織內(nèi)部，對(duì)宿主沒有造成（至少暫時(shí)）明顯病害癥狀的一類

2、真菌，它們普遍存在于植物組織中，具有豐富的物種多樣性。內(nèi)生真菌與宿主植物間長(zhǎng)期共存，并與宿主協(xié)同進(jìn)化，二者在演化的過程中形成了互利共生的關(guān)系。大量研究表明:藥用植物內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與宿主植物具有相同藥理活性的代謝產(chǎn)物，同時(shí)，它們也可以產(chǎn)生一些新化合物。因此，內(nèi)生真菌已逐漸成為一類篩選大量活性產(chǎn)物的寶貴資源。
　　本研究從狹葉南五味子根莖中分離出內(nèi)生真菌，并分析其物種多樣性以及分布規(guī)律。同時(shí)，篩選出具有生物催化活性的內(nèi)生真菌，并對(duì)產(chǎn)物

3、進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。本研究將為探討?yīng)M葉南五味子與其內(nèi)生真菌的關(guān)系、內(nèi)生真菌的演替規(guī)律，以及進(jìn)一步開發(fā)利用狹葉南五味子中的活性成分奠定基礎(chǔ)。
　　本研究利用表面消毒法，從采自云南省馬關(guān)縣以及西疇縣的狹葉南五味子根、莖中共分離得到426株內(nèi)生真菌，其中西疇縣莖部170株，西疇縣根部84株，馬關(guān)縣根部172株?；谛螒B(tài)特征初步確定其分類地位，結(jié)果表明:除了其中21株內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)生孢子被歸為無(wú)孢菌群(Mycelia Steril

4、ia，相對(duì)分離頻率4.93％)外，剩余的405株初步劃分為41個(gè)屬，其中輪枝孢屬（Verticillium）和青霉屬（Penicillium）為優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)分離頻率(RF)分別為16.43％和11.27％。多樣性指數(shù)（物種數(shù)、物種豐富度、Shannon-Weiner指數(shù)、Simpson指數(shù)和物種均勻度）分析表明:內(nèi)生真菌的聚集顯著有賴于樣品部位以及樣品地點(diǎn)。就組織特異性而言，在西疇縣狹葉南五味子中共分離的到254株內(nèi)生真菌，分屬于3

5、3個(gè)分類單元，其中14個(gè)在狹葉南五味子根、莖中都有發(fā)現(xiàn)，11僅存在于莖部，8個(gè)僅存在于根部;就地點(diǎn)特異性而言，西疇縣根部?jī)H有84株，分屬于22個(gè)分類單元，而馬關(guān)縣根部各分離得到172株內(nèi)生真菌，分屬于30個(gè)分類單元。
　　利用薄層色譜(簡(jiǎn)稱TLC)技術(shù)，從挑選的134株內(nèi)生真菌中篩選得到39株內(nèi)生菌對(duì)狹葉南五味子具有明顯的催化活性。根據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和分子生物學(xué)(ITS1-5.8S-ITS2)鑒定結(jié)果，這39株內(nèi)生真菌隸屬于11個(gè)屬（

6、Colletotrichum，Eupenicillium，F(xiàn)usarium,Hypoxylon, Penicillium,Phomopsis, Tramete,Trichoderma,Umbelopsis,Verticillium,Xylaria）。從這39株具有催化活性的內(nèi)生真菌中挑選出一株轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的菌株Eupenicilliumbrefeldianum SWUKD2.0300，以宿主材料為培養(yǎng)基擴(kuò)大發(fā)酵，利用硅膠柱層析和Seph

7、adexLH-20柱層析等技術(shù)對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，共分離得到2個(gè)化合物。應(yīng)用波譜技術(shù)解析其化學(xué)結(jié)構(gòu)，鑒定出這兩種化合物分別為布雷菲德菌素A(Brefeldin A，簡(jiǎn)稱BFA)和12-methoxy-brefeldin A，其中，12-methoxy-brefeldin A為一種新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。
　　通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化了內(nèi)生真菌布雷正青霉E.brefeldianum SWUKD2.0300產(chǎn)胞外布雷菲德菌素A的液體

8、發(fā)酵條件。最佳的布雷菲德菌素A發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基含馬鈴薯200g/L煮汁、蔗糖20.0g/L、CuSO40.02g/L、CaCO35g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO4·7H2O2.0g/L,pH=7;裝瓶量為100mL/250mL三角瓶，轉(zhuǎn)速為170rpm，28℃下培養(yǎng)8天,BFA的產(chǎn)量可達(dá)到200.0mg/L發(fā)酵液。與此同時(shí)，菌株SWUKD2.0300在固體沙氏、PDA、馬丁氏、胡蘿卜、查氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，且具有水解纖維素