HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖過程的作用和機(jī)制研究.pdf

1、膽管癌是一種呈高度侵襲性的惡性腫瘤，根據(jù)其發(fā)生部位可分為肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌和肝外膽管癌。雖然膽管癌發(fā)生率較低，但因其惡性程度較高給膽管癌的治療造成一定的困難。膽管癌的危險(xiǎn)因素主要有肥胖、膽汁淤積及DNA甲基化等。慢性炎癥在膽管癌的發(fā)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，比如慢性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎，肝硬化等，已經(jīng)成為膽管癌重要的癌前病變和高危因素。
　　高遷徙率族蛋白（High mobility group box1，HMGB-1

2、）在真核生物的細(xì)胞核中廣泛的表達(dá)，但受到一定的刺激時(shí)，HMGB-1可釋放到細(xì)胞外，作為損傷模式相關(guān)分子，參與炎癥因子的釋放及其他免疫反應(yīng)。HMGB-1在炎性反應(yīng)及癌癥的發(fā)展過程中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HMGB-1可通過NF-κB(nuclear factor kappa B)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。在肝癌的動(dòng)物模型及人乳腺癌的研究過程中也發(fā)現(xiàn)，HMGB-1可明顯促進(jìn)腫瘤的發(fā)展過程。HMGB-1被釋放到細(xì)胞外可激活NF-κB

3、及PI-3K(phosphatidylinositol-3-kinase)從而激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，刺激腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲和轉(zhuǎn)移并抑制其凋亡。最近的研究表明，HMGB-1可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的侵襲，但是否可促進(jìn)膽管癌的增殖作用，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　目的：
　　1.收集2010年1月-2015年1月間在南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的膽管癌患者的病歷資料及病理標(biāo)本，免疫組化檢測(cè)HMGB-1在膽管癌患者及其癌旁組織中的表達(dá)

4、。分析HMGB-1的表達(dá)與膽管癌患者臨床分期，分化程度，腫瘤大小及是否發(fā)生轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系;分析HMGB-1的表達(dá)量與患者生存時(shí)間之間的關(guān)系。
　　2.收集膽管癌及膽結(jié)石患者的膽汁，色譜法分析膽汁中結(jié)合膽汁酸和游離膽汁酸的含量。
　　3.觀察HMGB-1與膽汁酸(TCA，DCA)對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖及炎癥發(fā)生過程中的相互作用。
　　方法：
　　1.收集2010-2015年間膽管癌患者的臨床資料及病理組織，做免疫組化分析

5、，根據(jù)Bannar法對(duì)HMGB-1的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分;Western blotting方法檢測(cè)膽管癌及其癌旁組織組織中HMGB-1的表達(dá)。
　　2.采用Kapan-Meier生存分析法HMGB-1的表達(dá)量與患者生存時(shí)間的關(guān)系，運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，單因素及多因素進(jìn)一步分析膽管癌患者的生存時(shí)間與TNM分期、腫瘤大小、分化程度、血管轉(zhuǎn)移、神經(jīng)轉(zhuǎn)移等之間的關(guān)系。
　　3.收集膽管癌及膽管結(jié)石患者ERCP術(shù)后膽汁酸各20例高效液相色譜

6、法分析膽汁中結(jié)合膽汁酸(TCA)、游離膽汁酸(DCA)的含量。
　　4.qRT-PCR及western blotting測(cè)HMGB-1在膽管癌細(xì)胞株及膽管上皮細(xì)胞HIBEPic中的表達(dá);ELISA檢測(cè)HMGB-1在膽管癌患者及膽結(jié)石患者膽汁中的釋放量。
　　5.不同濃度的TCA(900μM)，DCA(400μM)分別刺激膽管癌細(xì)胞(HuCCT-1，RBE)48小時(shí)，qRT-PCR，western blotting和ELISA

7、觀察HMGB-1在mRNA和蛋白水平的變化。
　　6.不同濃度的TCA(900μM)，DCA(400μM)和HMGB-1(10ng/ml)單獨(dú)或聯(lián)合作用刺激膽管癌細(xì)胞株(HuC CT-1，RBE)24，48和72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)分為以下幾組:空白組、NC組、TCA組、DCA組、HMGB-1組、“HMGB-1+TCA”組、“HMGB-1+D CA”組，CCK8檢測(cè)細(xì)胞的增殖作用。
　　7.不同濃度的TCA（900μM），DCA(40

8、0μM)和HMGB-1(10ng/ml)單獨(dú)或聯(lián)合作用刺激膽管癌細(xì)胞株(HuCCT-1，RBE)48小時(shí)，實(shí)驗(yàn)分為以下幾組:空白組、NC組、TCA組、DCA組、HMGB-1組、“HMGB-1+TCA”組、“HMGB-1+DCA”組。qRT-PCR檢測(cè)RAGE，S1PR2，IL-6，IL-1α，TNFα的表達(dá)。
　　8.Kaplan-Meier法計(jì)算HMGB-1與膽管癌患者總體生存時(shí)間及無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：<

9、br>　　1.HMGB-1在不同的膽管癌患者中的表達(dá)量亦不相同，RAGE在膽管癌組織中的表達(dá)明顯高于其癌旁組織;HMGB-1的表達(dá)量與腫瘤的大小、分化程度、TNM分期均有明顯的正相關(guān)。
　　2.HMGB-1在體積較大的膽管癌患者組織中高表達(dá);HMGB-1可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖，且在一定的時(shí)間內(nèi)，隨濃度的增加刺激作用也明顯增強(qiáng)。
　　3.HMGB-1在膽管癌患者膽汁中的含量明顯高于膽結(jié)石患者;HMGB-1在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)明

10、顯高于正常膽管上皮細(xì)胞。
　　4.TCA可明顯促進(jìn)HMGB-1的釋放，而DCA的促進(jìn)作用不明顯。
　　5.TCA可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖;DCA可抑制膽管癌細(xì)胞的增殖;HMGB-1可協(xié)同TCA對(duì)膽管癌細(xì)胞的增殖作用，而減弱DCA對(duì)膽管癌細(xì)胞的抑制作用。
　　6.HMGB-1可促進(jìn)TCA受體(S1PR2)的表達(dá)，但抑制DCA受體(FXR)的表達(dá);HMGB-1與TCA協(xié)同可促進(jìn)EAGE，S1PR2及炎癥因子(IL-6，IL-