Sm22α基因敲除小鼠繁育方法的改進(jìn)及在宮縮乏力研究中的應(yīng)用.pdf

1、目的：平滑肌22α（smooth muscle22α，SM22α）是一種分子量22kDa的actin結(jié)合蛋白，用于血管平滑肌細(xì)胞分化及表型轉(zhuǎn)化的研究。Sm22α基因敲除（Sm22α-/-）小鼠在人類(lèi)相關(guān)疾病的研究中已得到廣泛應(yīng)用。然而，Sm22α-/-小鼠的傳統(tǒng)繁育方法產(chǎn)生的純合型子代數(shù)量較少，且易出現(xiàn)宮內(nèi)窘迫，引起母、胎鼠死亡，無(wú)法滿足相關(guān)研究的需要。本文對(duì)Sm22α-/-小鼠的傳統(tǒng)繁育方法進(jìn)行改進(jìn)，提高子代小鼠的純合率，進(jìn)而初步探討

2、宮內(nèi)窘迫發(fā)生的機(jī)制。
　　方法：⑴采用純合子交配方式即雄性純合子與雌性純合子交配，并對(duì)有分娩征兆的孕鼠實(shí)施剖腹產(chǎn)手術(shù)，剖出的仔鼠由 ICR雌鼠代乳。同時(shí)用傳統(tǒng)的雜合子交配方式即雄性純合子與雌性雜合子交配作為對(duì)照，比較兩種繁育方式的雌鼠受孕率及產(chǎn)生仔鼠的斷乳后存活率。⑵利用化學(xué)消化法提取兩種交配方式產(chǎn)生的子代小鼠的基因組DNA，聚合酶連式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)目的片段；PCR擴(kuò)

3、增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外凝膠成像儀下分析小鼠基因型并計(jì)算兩種繁育方法產(chǎn)生子代的純合率。⑶解剖分離野生型（Sm22α+/+）雌鼠與 Sm22α-/-雌鼠的子宮，觀察比較其大體形態(tài)；通過(guò)組織冰凍切片HE染色，觀察子宮壁的形態(tài)結(jié)構(gòu)，應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算子宮中膜平滑肌肌層相對(duì)厚度（中膜肌層厚度與子宮壁厚度的比值），進(jìn)而探討敲除Sm22α對(duì)子宮平滑肌發(fā)育的影響。⑷應(yīng)用偶聯(lián)熒光基團(tuán)的鬼筆環(huán)肽分別對(duì)野生型及Sm22α-/-小鼠的子宮平滑肌組

4、織中的F-actin進(jìn)行冰凍切片熒光染色，熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，進(jìn)而定量分析F-actin的含量。⑸為了在細(xì)胞水平探討SM22α在子宮平滑肌收縮中的作用，應(yīng)用改良組織貼塊法培養(yǎng)野生型及Sm22α-/-小鼠子宮平滑肌細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特點(diǎn)并用特異性平滑肌肌動(dòng)蛋白（ smooth muscleα-actin，SMα-actin）的免疫熒光染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。⑹為了進(jìn)一步驗(yàn)證 SM22α在 actin聚合中的作用，分別對(duì)野

5、生型及Sm22α-/-小鼠的子宮平滑肌細(xì)胞中應(yīng)力纖維及SM22α進(jìn)行熒光染色分析，觀察二者的共定位情況并分析敲除 Sm22α基因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞中應(yīng)力纖維形成的影響。⑺所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①純合子繁育方式與傳統(tǒng)雜合子繁育方式相比，雌鼠受孕率分別為50％和60%，仔鼠斷乳后

6、存活率分別為87.70%和88.60%，且兩種繁育方式相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；②純合子繁育方式與傳統(tǒng)雜合子繁育方式產(chǎn)生子代的純合子率分別為100%和47%，基本符合孟德?tīng)栠z傳定律；③與野生型相比，Sm22α-/-雌鼠子宮大體形態(tài)無(wú)明顯差異，但其中膜平滑肌肌層相對(duì)厚度較小，與野生型相比具有顯著差異（P<0.05）；④組織熒光染色結(jié)果顯示，Sm22α-/-小鼠與野生型小鼠相比子宮平滑肌纖維中細(xì)胞骨架蛋白F-actin的相對(duì)含量偏

7、低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明SM22α影響actin的聚合；⑤成功培養(yǎng)野生型與Sm22α-/-小鼠原代子宮平滑肌細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為梭形并呈典型的“峰-谷”樣生長(zhǎng)；特異性的SMα-actin免疫熒光染色顯示，單層細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞率在95%以上；⑥子宮平滑肌細(xì)胞應(yīng)力纖維熒光染色結(jié)果顯示，在野生型小鼠子宮平滑肌細(xì)胞中，應(yīng)力纖維呈束狀，平行排列，SM22α與應(yīng)力纖維共定位；而Sm22α-/-小鼠的子宮平滑肌細(xì)胞中，