SM22α敲除小鼠血管轉錄組學分析及差顯基因的功能驗證.pdf

1、目的:平滑肌22 alpha(Smooth muscle22 alpha，SM22α)是血管平滑肌細胞分化的標志蛋白之一，其在很多血管疾病，如動脈粥樣硬化，血管再狹窄和腹主動脈瘤中表達下調。然而，SM22α的表達下調是主動參與了血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，還是疾病進展過程中的被動表現(xiàn)，是一個未解的問題。利用轉錄組測序分析不僅可以發(fā)現(xiàn)疾病相關的生物功能和信號通路的富集基因，而且還可以發(fā)現(xiàn)新的靶分子。?；撬嵘险{基因1(Taurineupregul

2、ated gene1，TUG1)的表達產(chǎn)物是一種長鏈非編碼RNA(Longnoncoding RNA，lncRNAs)，在細胞核和細胞質中均有表達。但是有關TUG1的確切功能和作用機制尚不清楚。
　　方法:本文基于RNA-Seq技術，對SM22α基因敲除小鼠和其同窩野生型小鼠主動脈組織進行轉錄組測序及生物信息學分析和驗證，旨在發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞中SM22α相關的生物過程調控機制。探討胞漿定位的TUG1的作用及其對血管平滑肌細胞(V

3、ascular smooth muscle cell，VSMC)細胞骨架動力學的調節(jié)。
　　結果:
　　1 SM22α基因敲除小鼠主動脈轉錄組測序分析
　　1.1通過RNA測序產(chǎn)生的SM22α基因敲除小鼠與野生型小鼠血管差異表達基因
　　選取基因表達量差異倍數(shù)在2倍及以上的基因為差異表達基因進行生物信息學分析。結果顯示，在1398個差異表達的基因中，959(56.0％)基因表達上調，而439(25.6％)基因表達

4、下調。大多數(shù)的差顯基因是蛋白質編碼基因，約315(18.4％)為未知/假設功能基因。隨機選擇12個基因進行定量RT-PCR驗證，并對定量RT-PCR與RNA測序分析結果RNA倍數(shù)的變化進行了比較。在SM22α基因敲除所導致的差異表達基因中，血紅蛋白(Hb)、載脂蛋白CI(ApoCI)和G0/G1開關基因2(G0s2)高度表達。其中基于FPKM值和改變倍數(shù)綜合考慮分析，血紅蛋白和載脂蛋白CI是SM22α基因敲除所引起的差異表達最顯著的基因

5、。
　　1.2差異表達基因的GO分析
　　GO分析顯示，差異表達基因所定位的亞細胞間區(qū)多與細胞膜、突觸、胞外區(qū)和細胞交界處相關。GO生物過程分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達基因主要與信號轉導、發(fā)育、物質運輸和細胞通訊等過程相關。GO分子功能分析結果顯示，這些基因的編碼產(chǎn)物主要是配體、酶、受體和結構蛋白。
　　1.3差異表達基因的PANTHER分析
　　使用PANTHER軟件對差異表達基因編碼的蛋白進行分類。結果顯示，差異表

6、達基因編碼的蛋白在“受體”類型中富集最多，這與前面的GO分子功能分析結果非常相似。對“受體”進行再分類，結果顯示為“G蛋白偶聯(lián)受體”和“細胞因子受體”為最主要的兩大類受體。差異表達的基因在“G蛋白偶聯(lián)受體”中包括的基因主要與細胞增殖和血管平滑肌細胞遷移功能相關。差異表達的基因在“細胞因子受體”這一類蛋白分類中，主要與協(xié)調免疫和炎癥反應方面的功能相關。
　　1.4差異表達基因的信號通路分析
　　使用KEGG、BioCarta和

7、IPA分別進行信號通路分析。KEGG中富集的通路，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、造血細胞系和細胞因子，細胞因子受體相互作用。在BioCarta信號通路分析中富集的通路為與造血有關的細胞因子、參與脂質代謝和毒性核受體和細胞因子調節(jié)炎癥反應。IPA經(jīng)典途徑分析結果顯示，差異表達基因在LXR/RXR激活、動脈粥樣硬化信號途徑、先天和適應性免疫細胞間信號傳導、樹突狀細胞成熟、T細胞和B細胞分泌途徑、鈣和肌萎縮性側索硬化癥等信號途徑富集?？傮w而

8、言，KEGG、BioCarta和IPA分析均表明，造血細胞因子、炎癥和脂質代謝是SM22α基因缺失激活的最主要的三個信號通路。
　　1.5差異基因的轉錄因子和調控網(wǎng)絡分析
　　使用IPA轉錄因子分析功能可以鑒定差異基因數(shù)據(jù)集中發(fā)生顯著變化的基因的上游轉錄因子。IPA轉錄因子分析結果表明，SM22α基因敲除后有6個轉錄調節(jié)因子被激活或抑制:RELA/NF-κB、KLF2、RXRα、PPARα、JUN和NUPR1。其中，TNF可

9、被NF-κB、RXRα、JUN和KLF2調控。CXCR4可由NF-κB、KLF2和NUPR1激活。這些結果表明，SM22α基因缺失可導致炎癥調節(jié)途徑的激活。
　　差異表達基因的IPA潛在調控網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)存在10個基因調控網(wǎng)絡，涉及的主要生物學功能有:參與細胞信號傳導、脂質代謝和心血管疾病。而通過IPA分析差異基因所導致的下游生物學效應，即疾病和功能分析，顯示SM22α基因缺失所導致的疾病過程和生物學功能主要與動脈粥樣硬化、低血壓、

10、動脈閉塞、血管和動脈疾病相關。
　　2轉錄組測序分析結果的驗證:SM22α缺失促進了血管疾病的發(fā)生
　　2.1 IPA分析差異基因所導致的下游生物學效應和信號通路分析
　　通過IPA分析差異基因所導致的下游生物學效應，即疾病和功能分析，顯示SM22α基因缺失所導致的疾病過程和生物學功能主要與動脈粥樣硬化、動脈硬化、低血壓、動脈閉塞、血管和動脈疾病相關。其中，有45個基因在動脈粥樣硬化疾病中富集，推測SM22α基因缺失后

11、可能已經(jīng)啟動了早期的動脈粥樣硬化疾病分子的改變。我們選取這些富集基因中的與早期炎癥（TNF和IL-18）和脂代謝(LPL、ApoAⅡ、Adiponectin和ApoCI)相關的基因在SM22α基因敲除和其野生型小鼠的主動脈中進行RT-PCR驗證。結果顯示，SM22α基因缺失后TNF、IL-18、LPL、ApoAⅡ和ApoCI表達均顯著上調，而Adiponectin表達水平則顯著下降。證明動脈粥樣硬化早期相關基因與SM22α有著明顯的相關

12、性。
　　早期的動脈粥樣硬化實際上是炎癥反應，其中NF-κB是關鍵的炎癥反應分子。在SM22α基因敲除小鼠中，TNF mRNA水平表達明顯上調。信號通路分析進一步顯示，TNF的表達上調激活了NF-κB信號通路的活化。
　　2.2敲低SM22α促進TNF-α誘導的IBα磷酸化和總IκBα的降解
　　利用Western blot分析檢測敲低SM22α后對IBα磷酸化的影響。結果顯示，處于靜止期的VSMCs中，IκBα磷酸化

13、水平很低。給予TNF-α刺激或者敲低SM22α后，IκBα的磷酸化水平均明顯升高，總IκBα水平顯著降低(P＜0.05)。敲低SM22α后再給予TNF-α(10 ng/mL)刺激15 min，與對照組和單獨TNF-α刺激相比，IκBα磷酸化水平的升高和總IBα水平的降低均更明顯(P＜0.05)，說明敲低SM22α可以誘導IκBα的磷酸化，加速總IBα的降解，進而促進TNF-α介導的NF-κB p65的活化。
　　2.3敲低/過表達

14、SM22α增強/抑制TNF-α誘導的NF-κB p65活化與核轉位
　　為了確定SM22α和TNF-α介導的NF-κB信號通路的活化之間的關系，我們采用SM22α特異性小干擾RNA（siSM22α）轉染VSMC，觀察敲低SM22α后對TNF-α誘導的NF-κB活化和核轉位的影響。Western blot分析結果顯示，靜止期VSMC中NF-κB p65主要在細胞胞漿中表達，而細胞核中的表達水平較低。給予TNF-α刺激或者敲低SM22

15、α后，細胞核中的NF-κB p65水平顯著上調;敲低SM22α后再給予血管平滑肌細胞TNF-α(10 ng/mL)刺激15 min，結果表明，NF-κB p65核轉位水平明顯高于對照組(P＜0.05)。上述實驗結果表明，敲低SM22α增強了TNF-α誘導的NF-κB p65活化與核轉位。
　　為了進一步驗證SM22α在TNF-α誘導的VSMC炎癥應答中的作用，利用SM22α腺病毒表達載體轉染使SM22α在VSMC中過表達，觀察其對

16、NF-κB活化及核轉位的影響。Western blot分析結果顯示，給予TNF-α刺激后，與單獨TNF-α刺激相比，過表達SM22α可抑制TNF-α誘導的NF-κB p65核轉位。上述結果表明，過表達SM22α可抑制TNF-α誘導的NF-κB p65激活。
　　2.4 SM22α基因缺失導致ApoCI表達水平升高
　　動脈粥樣硬化疾病發(fā)生時除炎癥外，另一個事件就是脂質沉積。有研究表明ApoCI在心血管疾病脂質代謝過程中起到一

17、個節(jié)點作用。RNA測序結果顯示SM22α基因缺失后，ApoCI mRNA表達水平升高。我們隨后又在SM22α基因敲除和野生型小鼠的胸腹主動脈中檢測了ApoCI蛋白的表達水平，Western blot分析結果顯示，ApoCI在SM22α基因缺失小鼠中表達水平升高;采用SM22α特異性小干擾RNA(siSM22α)轉染血管平滑肌細胞后，結果顯示，敲低SM22α后可促進ApoCI的表達。
　　免疫組織化學染色法分別檢測ApoCI在SM2

18、2α-/-和SM22α+/+小鼠頸動脈中的表達情況。結果顯示，ApoCI在SM22α-/-和SM22α+/+小鼠頸動脈中均有表達，且在SM22α-/-小鼠頸動脈中的表達水平顯著高于對照野生型小鼠;為了檢測ApoCI在血管疾病中的表達情況，采用頸總動脈結扎模型，免疫組化顯示ApoCI在SM22α-/-小鼠中的表達量也明顯高于野生對照結扎組。為了檢測SM22α基因的缺失是否也影響了血脂水平，分別取禁食8-12 h的SM22α-/-和SM22

19、α+/+小鼠血清檢測血清中的膽固醇和甘油三酯。結果表明，SM22α-/-小鼠中的甘油三酯水平高于野生型，而總膽固醇水平則低于野生型小鼠。
　　2.5 SM22α基因缺失小鼠易于發(fā)生血管疾病
　　為了檢測SM22α基因缺失后是否影響了血管細胞的黏附和遷移，我們采用免疫組織化學染色法分別檢測細胞黏附和遷移相關分子的表達，包括MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、MMP-2和MMP-9的表達。結果表明，與野生型相比，在SM22α

20、-/-小鼠血管中，ICAM-1、VCAM-1、MMP-2和MMP-9表達水平均明顯上調，而MCP-1表達水平在兩種血管中無明顯變化。
　　為了檢測SM22α基因缺失小鼠是否易于發(fā)生血管疾病。我們利用血管結扎模型對SM22α-/-和SM22α+/+小鼠一側頸總動脈進行結扎。結果顯示，與對照組相比，SM22α-/-小鼠在結扎的第14天血管內膜明顯增厚。上述實驗結果表明，SM22α基因的正常表達對于維持血管穩(wěn)態(tài)來說是必須的，缺失該基因的

21、小鼠則易于發(fā)生血管疾病。
　　3長鏈非編碼RNA TUG1參與EZH2介導的α-actin的甲基化促進VSMC皮層細胞骨架的形成
　　3.1大鼠中存在長鏈非編碼RNA TUG1
　　通過序列比對和同源性分析，預測得到大鼠TUG1基因位于大鼠14號染色體上，在基因組上也與MORC family CW-typezinc finger2基因相鄰。通過PCR擴增出大鼠TUG1 RNA基因4612 bp的全長片段，序列分析顯示大

22、鼠TUG1基因和小鼠一樣均含有4個外顯子，而人TUG1基因則含有3個外顯子。大鼠TUG1與小鼠和人序列一致性分別為93.0％和75.5％。Real-timePCR結果顯示，血清饑餓誘導體外培養(yǎng)的VSMC后，TUG1表達水平降低。證實大鼠VSMC表達TUG1。
　　3.2胞漿EZH2與細胞皮層F-actin形成相關
　　以往研究認為EZH2主要存在于細胞核中，胞漿中也存在表達且與細胞偽足的形成有關。Western blot結果

23、顯示，與增殖VSMC相比，血清饑餓72 h誘導VSMC分化后，EZH2表達下降;EZH2在VSMC細胞核及胞漿中均有分布，并且血清饑餓誘導VSMC分化后，EZH2在胞漿中的表達減少。免疫熒光分析顯示，在胞漿中的EZH2部分與細胞邊緣部位F-actin共定位。結果表明，在VSMC胞漿中高表達的EZH2可能參與了VSMCs細胞皮層骨架的形成過程。
　　3.3非編碼RNA TUG1與EZH2、α-actin存在相互作用，TUG1敲低后促

24、進EZH2出核
　　為了驗證VSMCs中TUG1/EZH2/α-actin是否存在相互作用，進行RNApull down實驗。其結果初步顯示，體外合成生物素標記的TUG1 RNA探針可與EZH2和α-actin存在相互作用而其反義鏈探針不能檢測該作用，證明在VSMCs中非編碼RNA TUG1與EZH2、α-actin存在相互作用。
　　Western blot和細胞免疫熒光結果均顯示，敲低TUG1后促進EZH2出核，導致EZ

25、H2胞漿定位增多。該變化與PDGF刺激VSMC作用相似。
　　3.4 TUG1/EZH2介導的α-actin甲基化參與細胞皮層F-actin的形成
　　為了確定TUG1是否對F-actin介導的細胞骨架動力學產(chǎn)生影響，敲低TUG1后，分步提取G-actin和F-actin。Western blot結果顯示，敲低TUG124h后，F(xiàn)-actin/G-actin比值下降，表明皮層細胞骨架動力學有賴于TUG1。
　　通過蛋白

26、甲基化位點預測軟件PLMLA及序列分析顯示，α-actin分子中存在多個賴氨酸甲基化潛在位點，其中193位賴氨酸甲基化位點發(fā)生甲基化的可能性最大。為了揭示TUG1、EZH2和α-actin三者相互作用的意義，利用賴氨酸甲基化抗體進行免疫沉淀。結果顯示，α-actin可以發(fā)生賴氨酸甲基化，敲低TUG1后其甲基化程度減少，伴隨F-actin的解聚。表明TUG1與EZH2的結合可使α-actin甲基化，后者促進F-actin的聚合，參與皮層細

27、胞骨架的形成。
　　結論:
　　1 SM22α基因敲除后引起的上調基因數(shù)目遠遠大于下調的基因數(shù)目，差異表達的基因編譯的蛋白主要是位于細胞膜上的G-蛋白偶聯(lián)受體;造血細胞因子，炎癥和脂質代謝是SM22α基因缺失激活的最主要的三個信號通路;SM22α基因敲除后RELA/NF-κB被激活。
　　2 SM22α基因敲除小鼠血管細胞細胞黏附和遷移分子活性增強，是一種早期血管炎癥模型。
　　3大鼠血管平滑肌細胞表達長鏈非編碼