男性脫發(fā)癥病變毛囊與正常毛囊的差異性研究.pdf

1、男性脫發(fā)癥(AGA)是世界上最常見(jiàn)的皮膚疾病之一，困擾著我國(guó)超過(guò)1億的成年男性。且其發(fā)病率隨著我國(guó)社會(huì)生活的快節(jié)奏化和人口老齡化，而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。已知AGA的主要誘因是雄激素雙氫睪酮(DHT)體內(nèi)濃度改變。另外遺傳背景、營(yíng)養(yǎng)狀況、精神壓力、衰老程度、免疫反應(yīng)、外來(lái)?yè)p傷等因素也在AGA發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。但這種疾病的具體發(fā)病機(jī)制至今仍不完全清楚。目前臨床上可用于治療AGA的藥物僅有抑制DHT生成的Finasteride和血管

2、擴(kuò)張劑Minoxidil兩種。前者有影響男性性功能的潛在副作用，后者在停藥后會(huì)導(dǎo)致更為嚴(yán)重的脫發(fā)，在臨床上均難以實(shí)現(xiàn)理想的療效。而開(kāi)發(fā)更為有效的AGA治療方法將需要我們深入解析AGA的發(fā)病機(jī)制，并開(kāi)發(fā)其針對(duì)性的干預(yù)手段。
　　男性脫發(fā)具有較為固定的發(fā)展模式。一般前額與頭頂部最先禿發(fā)，而枕后部區(qū)域的毛發(fā)則保持生長(zhǎng)。將枕后部毛囊移植到前額禿發(fā)區(qū)仍可正常生長(zhǎng)毛發(fā)，提示毛發(fā)生長(zhǎng)停滯的根本原因在于毛囊自身而非其周邊環(huán)境(20世紀(jì)50年代提出

3、的“優(yōu)勢(shì)供區(qū)”理論)。毛發(fā)生長(zhǎng)由毛囊內(nèi)部的毛囊干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，并隨著這些干細(xì)胞在激活與靜止?fàn)顟B(tài)之間的來(lái)回切換而呈現(xiàn)出生長(zhǎng)-退行-休止的周期性循環(huán)。在AGA的發(fā)病過(guò)程中毛囊逐步萎縮，生長(zhǎng)期縮短，休止期延長(zhǎng)，最終失去再生毛發(fā)的能力。但我們對(duì)毛囊干細(xì)胞在這個(gè)疾病過(guò)程中的病理轉(zhuǎn)變過(guò)程及其機(jī)制仍然缺乏了解。有研究顯示脫發(fā)區(qū)域中的毛囊干細(xì)胞并未消失，只是處于異常的休止?fàn)顟B(tài)而無(wú)法產(chǎn)生毛發(fā)。而闡明這種異常休止?fàn)顟B(tài)的分子機(jī)制將為其針對(duì)性治療方案的開(kāi)發(fā)提供線索

4、。
　　既往文獻(xiàn)中對(duì)AGA的病理學(xué)分析多基于禿發(fā)頭皮與健康頭皮的直接對(duì)比。但完全禿發(fā)區(qū)域的毛囊往往存在結(jié)構(gòu)異常、脂溢、感染、發(fā)炎等現(xiàn)象。不易區(qū)分導(dǎo)致脫發(fā)的直接病理因素與次生現(xiàn)象，也未能闡明毛囊干細(xì)胞在AGA發(fā)展過(guò)程中的病理轉(zhuǎn)變過(guò)程。在本課題中，為了深入闡明毛囊干細(xì)胞在AGA發(fā)病中的病理轉(zhuǎn)變過(guò)程及其分子機(jī)制，本人將從脫發(fā)癥患者前額脫發(fā)區(qū)邊緣剛開(kāi)始毳毛化但尚未完全禿發(fā)的臨界區(qū)域中收集毛囊樣品，并與來(lái)自同一患者的枕后部未脫發(fā)區(qū)頭皮及健康

5、人頭皮的毛囊樣品進(jìn)行對(duì)比分析，解析它們?cè)谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)以及其中毛囊干細(xì)胞數(shù)量、位置、增殖、分化上的差異。隨后，本人還將開(kāi)發(fā)一套從人類(lèi)毛囊樣品中分離純化毛囊干細(xì)胞的有效技術(shù)手段，并在國(guó)際上首次嘗試對(duì)脫發(fā)臨界區(qū)及對(duì)照區(qū)域的毛囊干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組比較分析。通過(guò)這些研究，我將進(jìn)一步揭示AGA發(fā)病的毛囊干細(xì)胞機(jī)制，為開(kāi)發(fā)AGA的新型靶向治療方案奠定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　(1)對(duì)比AGA脫發(fā)臨界區(qū)、枕后區(qū)以及正常人群枕后區(qū)的毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)及其中

6、的毛囊干細(xì)胞數(shù)量、位置、增殖、分化之間的差異。
　　(2)建立從頭皮樣品中分離純化人類(lèi)毛囊干細(xì)胞的技術(shù)體系。
　　(3)建立對(duì)微量毛囊細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)體系，并轉(zhuǎn)錄組分析探索AGA脫發(fā)臨界毛囊干細(xì)胞與正常毛囊干細(xì)胞的基因表達(dá)差異。
　　方法：
　　(1)對(duì)AGA人群脫發(fā)臨界區(qū)、枕后區(qū)與正常人群（男、女）枕后區(qū)的毛囊進(jìn)行解剖觀察不同毛囊組間的形態(tài)學(xué)差異，測(cè)量毛囊單位的生長(zhǎng)期毛囊數(shù)量以及生長(zhǎng)期毛囊的長(zhǎng)度;通過(guò)對(duì)

7、不同組間毛囊進(jìn)行免疫組化分析，分別從毛囊的結(jié)構(gòu)、干細(xì)胞、增殖等方面進(jìn)行對(duì)比分析，獲得病變與正常毛囊的基本數(shù)據(jù)，旨在能系統(tǒng)性分析病變與正常毛囊間的大體存在的差異性。
　　(2)擬以顯微操作與酶消化法相聯(lián)合，通過(guò)DispaseⅡ分散酶從皮膚中分離毛囊，構(gòu)建一個(gè)毛囊模型。對(duì)所構(gòu)建的毛囊模型分別進(jìn)行HE染色、免疫組化實(shí)驗(yàn)，觀察毛囊結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證毛囊模型的純度及完整性。通過(guò)構(gòu)建毛囊模型，進(jìn)一步比較AGA臨界毛囊、AGA枕后毛囊與正常人毛囊的干細(xì)

8、胞含量的差異。同時(shí)通過(guò)磁珠免疫法進(jìn)一步純化毛囊細(xì)胞，為純化分離毛囊干細(xì)胞提供一種新的方法，并驗(yàn)證此方法的切實(shí)可行性。
　　(3)擬以REPLI-g WTA Single Cell Kit擴(kuò)增毛囊微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基因，NEBNextDNA Library Prep Master Mix Set for Illumina試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增后DNA建庫(kù)。通過(guò)NANO分光光度計(jì)、跑膠法觀察獲取轉(zhuǎn)錄組DNA的目的片段，PCR法、TA克隆等方法檢驗(yàn)

9、擴(kuò)增建庫(kù)水平，探討通過(guò)以上方法進(jìn)行微量細(xì)胞建庫(kù)的可行性與效率。
　　對(duì)比AGA前額組（脫發(fā)臨界）、AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組的基因表達(dá)譜分析，將進(jìn)一步揭示AGA發(fā)病的毛囊干細(xì)胞機(jī)制，為開(kāi)發(fā)AGA的新型靶向治療方案奠定基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：
　　(1)通過(guò)測(cè)量毛囊單位的生長(zhǎng)期毛囊數(shù)量以及生長(zhǎng)期毛囊的長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)，AGA前額組（脫發(fā)臨界）毛囊的長(zhǎng)度小于AGA枕后部毛囊的長(zhǎng)度(P=0.0014); AGA枕后部毛囊

10、的長(zhǎng)度小于正常男性枕后部、正常女性枕后部毛囊的長(zhǎng)度(P＜0.0001);而正常男性枕后組與正常女性枕后組無(wú)明顯差異。AGA前額部毛囊單位內(nèi)生長(zhǎng)期毛囊的根數(shù)比AGA枕部(P=0.0005)，正常男性枕部(P＜0.001)以及正常女性枕部(P＜0.001)都少，但其余三組之間無(wú)明顯差異。
　　(2)分別從毛囊的結(jié)構(gòu)、干細(xì)胞、增殖等方面進(jìn)行對(duì)比分析:CK14結(jié)構(gòu)蛋白染色未見(jiàn)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組毛囊之間結(jié)構(gòu)存在明顯差異;AGA枕后區(qū)、正常男性枕后區(qū)

11、及正常女性枕后區(qū)的CD200表達(dá)均位于毛囊隆突區(qū)位置，并且表達(dá)較強(qiáng)，AGA前額區(qū)隆突區(qū)域也明顯有CD200的陽(yáng)性表達(dá)，但較其他組明顯減弱;AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組的Ki67陽(yáng)性表達(dá)主要分布在毛球部上方、毛囊下1/4至1/5處，且其的表達(dá)量不高，與正常表皮的增殖情況一致。而AGA前額組（脫發(fā)臨界）的Ki67陽(yáng)性表達(dá)量明顯上調(diào)，且表達(dá)位置分布高至毛囊下1/2處，較其他組位置明顯增高。
　　(3)以人頭皮毛囊為實(shí)驗(yàn)材

12、料時(shí)，同時(shí)選擇“顯微分離技術(shù)-酶消化”法作為標(biāo)準(zhǔn)化毛囊模型的的制備方法，這種方法制備的毛囊模型結(jié)構(gòu)完整、純度高、損傷小。
　　(4)通過(guò)顯微分離技術(shù)、酶消化與免疫磁珠聯(lián)合法獲取的毛囊干細(xì)胞經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分析、細(xì)胞涂片法染色等方法進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)這種分離純化毛囊干細(xì)胞的策略能進(jìn)一步純化毛囊干細(xì)胞，細(xì)胞損失率降低。
　　(5)以構(gòu)建的毛囊標(biāo)準(zhǔn)化模型為基礎(chǔ)獲得的細(xì)胞組群進(jìn)行細(xì)胞含量分析，四個(gè)實(shí)驗(yàn)組毛囊內(nèi)所含CD200百分比個(gè)體差

13、異較大，有可能因?yàn)閭€(gè)體差異造成。但每個(gè)AGA患者自身比較發(fā)現(xiàn)，其枕后部毛囊CD200百分比含量均高于其前額部。
　　(6)通過(guò)AGA前額組（脫發(fā)臨界）、AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組四組間的基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)AGA枕后組基因表達(dá)譜與AGA前額（脫發(fā)臨界）組相近，與其他正常組差異明顯。說(shuō)明AGA枕后區(qū)雖然不表現(xiàn)脫發(fā)病變，但它仍存在某些顯著缺陷。
　　結(jié)論：
　　(1)AGA患者前額組（脫發(fā)臨界）明顯出現(xiàn)生

14、長(zhǎng)期毛囊減少，毛囊形狀變細(xì)、變短。而AGA枕后組較正常人（男、女）也出現(xiàn)了明顯的縮短。
　　(2)AGA前額組（脫發(fā)臨界）CD200干細(xì)胞表達(dá)量明顯減少，增殖細(xì)胞Ki67明顯增多。
　　(3)選擇“顯微分離技術(shù)-酶消化”法作為標(biāo)準(zhǔn)化毛囊模型的的制備方法，這種方法制備的毛囊模型結(jié)構(gòu)完整、純度高、損傷小。
　　(4)通過(guò)顯微分離技術(shù)、酶消化與免疫磁珠聯(lián)合法獲取的毛囊干細(xì)胞能進(jìn)一步純化毛囊干細(xì)胞，細(xì)胞損失率降低。