普魯蘭短梗霉HN2-3脂肪酶的生產(chǎn)、分離純化、基因克隆和表達(dá)的研究.pdf

1、從鹽場(chǎng)分離到一株高產(chǎn)脂肪酶的酵母菌HN2-3，經(jīng)酵母常規(guī)鑒定方法和分子生物學(xué)方法鑒定為普魯蘭短梗霉。該酵母生產(chǎn)脂肪酶最佳培養(yǎng)基組分為3.0％(w/v)橄欖油、0.4％(w/v)葡萄糖、0.6％(w/v)硫酸銨、0.1％(w/v)K2HPO4和0.05％(w/v)MgSO4.7H2O，最佳培養(yǎng)條件為初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度25℃和轉(zhuǎn)速170rpm。我們發(fā)現(xiàn)橄欖油的添加時(shí)間對(duì)于脂肪酶的生產(chǎn)具有很大的影響，在接種培養(yǎng)6h后加入橄欖油，繼續(xù)培

2、養(yǎng)96h，脂肪酶產(chǎn)量達(dá)到最大，酶活力達(dá)到8.0 U/ml。 普魯蘭短梗霉HN2-3胞外脂肪酶通過硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析和陰離子交換層析得到純化，純化倍數(shù)為3.4。SDS-PAGE顯示該脂肪酶分子量約為63.5 kDa。純化酶的最適作用pH和最適作用溫度分別為8.5和35℃，該酶被Hg2+ Fe2+和Zn2+強(qiáng)烈抑制。同時(shí)苯甲基磺酰氟可以強(qiáng)烈抑制該脂肪酶的活性。乙二胺四乙酸對(duì)該純化酶的影響不大，碘乙酸可以微弱抑制該酶的活性。純

3、化的脂肪酶對(duì)于花生油具有較強(qiáng)的水解活性。 利用RACE的方法克隆了普魯蘭短梗霉HN2-3胞外脂肪酶的基因。該基因含有一個(gè)1245bp的ORF框，同時(shí)發(fā)現(xiàn)從基因組克隆得到的脂肪酶基因序列中含有一個(gè)55bp的內(nèi)含子。該基因編碼一個(gè)414個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，在氨基端含有一個(gè)26個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。推導(dǎo)氨基酸序列含有脂肪酶的保守序列(G-X-S-X-G)和3個(gè)推測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)。通過脂肪酶系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，普魯，蘭短梗霉HN2-3

4、脂肪酶與Aspergillus fumigatus(XP_750543)和Neosartorya fischeri(XP 001257768)脂肪酶親緣關(guān)系最近，同源性分別為50％和51％。 將脂肪酶基因克隆到pET-24a(+)表達(dá)載體上，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了表達(dá)。SDS-PAGE和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白的分子量約為47kDa。測(cè)定了陽(yáng)性克隆BL21(DE3)/pET-24a(+)LIP1細(xì)胞裂解液的脂肪