家蠅幼蟲中耐高溫DNA酶活性蛋白的提純及其抗體的制備.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)存在著多種不同的核酸酶，但在目前已知的核酸酶中，既可以降解DNA，又具有耐熱特性的DNA酶還未見報道。本實驗利用DEAECellulose-52離子交換層析、SephadexG-75凝膠過濾層析等蛋白質(zhì)純化技術(shù)，成功的從孵化至5天的家蠅幼蟲中分離提純得到一種新的耐高溫且具有DNA酶活性的蛋白質(zhì)。 通過SDS-PAGE測定，提純的蛋白分子量約為58kDa，稱之為LP58(1arvaprotein58)。經(jīng)等電聚焦電泳測定，其

2、等電點(pI)約為4.6。LP58在100℃煮沸處理12min后仍具有酶的活性，證明其具有耐高溫的特性；取純化得到的LP5819μlLP58(0.6876mg/ml)分別與1μl的pGEM3ZF(-)(2.67mg/ml)質(zhì)粒和1μl的雞基因組(0.3453mg/ml)DNA37℃作用30分鐘，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測其既能降解質(zhì)粒，又能降解染色體DNA，推測LP58可能既具有內(nèi)切活性，又具有外切活性。測得酶比活力為200U/mg(酶活力單位：

3、37℃,30分鐘，每降解1μg質(zhì)粒所需要的酶量定義為1個活力單位U)。 將經(jīng)過DEAECellulose-52離子交換層析和SephadexG-75凝膠過濾層析純化的LP58進(jìn)行雙向電泳，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，進(jìn)行測序，測得其N端6個氨基酸序列為"Y-A-D-Y-D-F"。 此外，以LP58為抗原免疫豚鼠制備該蛋白的抗體，利用瓊脂雙向雙擴(kuò)散法測得血清效價為1：32；利用Westernblot雜交技術(shù)證實其能夠與家蠅幼蟲蛋白(